HSP-MUC1纯化工艺的研究

论文摘要

HSP-MUC1融合蛋白（HSP-MUC1）是将BCG来源的HSP65基因与人MUC1的CTL表位基因融合,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达获得的。HSP-MUC1可激活DC细胞,使DC表面的CD86表达上调,并进一步刺激产生MUC1特异性的CTLs,同时也激活非特异性抗肿瘤免疫反应,发挥抗肿瘤作用。为了获得高纯度、有活性的HSP-MUC1,我们摸索并建立了以细菌破碎和碎片分离、Phenyl-Sepharose层析和Q-Sepharose层析三步组成的HSP-MUC1纯化工艺流程:1、细菌破碎和碎片分离:在低温、1.5mol/L NaCl,50mmol/L Tris,pH值9.0的条件下超声破碎,低温高速离心（15000g）去除细菌碎片;2、Phenyl-Sepharose层析:采用了以电导值为45mS/cm和16mS/cm的洗脱缓冲液分别洗脱杂蛋白和HSP-MUC1;3、Q-Sepharose层析过程:采用了以10CV、电导值从1624mS/cm的缓冲液线性洗脱,得到高纯度的HSP-MUC1。HSP-MUC1降解是在纯化过程中遇到的最大问题。在不影响HSP-MUC1活性情况下,将纯化过程中涉及到的缓冲液pH值提高至9.0,可显著抑制HSP-MUC1的降解,可获得纯度大于95%的HSP-MUC1。利用等线速度原理,将小规模纯化工艺逐步放大至中试规模。在放大过程中,利用HSP-MUC1与Phenyl-Sepharose介质解离所需的离子强度范围较广的特点,通过调整洗脱HSP-MUC1的洗脱液电导值,获得高纯度的HSP-MUC1,确定了稳定的HSP-MUC1中试规模纯化工艺。HSP-MUC1中试规模纯化工艺的确定,不仅为HSP-MUC1临床前的药效学研究提供了足够、合格的样品,并为进一步开发HSP-MUC1的工业生产规模纯化工艺奠定了基础。

论文目录

• 提要
• 引言
• 1 蛋白质纯化路线的设计原则
• 2 蛋白质纯化路线放大过程中的优化原则
• 3 层析技术的主要类型
• 3.1 凝胶过滤层析
• 3.2 疏水作用层析
• 3.3 离子交换层析
• 3.4 亲和层析
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 主要方法
• 实验结果
• 1. HSP-MUC1 纯化流程的选择
• 1.1 PHENYL-SEHPAROSE 层析
• 1.2 Q-SEPHAROSE 层析
• 1.2.1 Q-Sepharose 层析上样条件
• 1.2.2 Q-Sepharose 层析洗脱条件
• 1.3 缓冲液PH 值的影响
• 1.4 HSP-MUC1 的纯化流程的确定
• 2. HSP-MUC1 纯化工艺的放大
• 2.1 初步放大
• 2.2 中试规模
• 讨论
• 1 HSP-MUC1 在纯化过程中的降解
• 1.1 介质选择和工艺路线的优化
• 1.2 缓冲液成份和条件的优化
• 2 工艺扩大过程中对具体参数的调整
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢