基于DNA改组的MIF高亲和力受体突变体的筛选

论文摘要

巨噬细胞抑制因子（Macrophage-inhibitory factor, MIF ）是最早被阐述的细胞因子之一,已有的研究表明,MIF高表达是引起脓毒症、糖皮质激素拮抗、类风湿性关节炎、肿瘤的等病理过程的主要原因。有研究者以抗MIF单克隆抗体处理脓毒症小鼠,发现可显著提高其存活率,提示阻断MIF的作用可抑制MIF高表达所引起的病理过程。但MIF保守性较高,抗体制备困难;且抗体进入临床应用,人源化问题是一大障碍。近期研究发现,CD74（MHC II恒定链辅助分子）胞外区73-232 aa （sCD74）是MIF的天然受体,阻断MIF与CD74的结合可以阻断由MIF介导的信号通路。MIF受体的发现,为抑制MIF高表达提供一种新的选择——受体竞争。DNA改组技术是一种简单高效的蛋白质体外进化技术,已有许多分子通过DNA改组具有了更高的亲和力、更高的催化活性或更好的稳定性。本研究拟利用DNA改组技术（DNA shuffling）对sCD74基因进行改组,结合T7噬菌体表面展示技术（T7 phage display）,筛选一株高亲和力结合MIF的突变体,并进行初步鉴定,为寻找一种具有潜在临床治疗前景的MIF抑制剂奠定基础。主要研究内容和结果1.sCD74的原核表达与验证（1）sCD74-pQE-80L重组载体的构建、原核表达与纯化:以Genebank查询的人CD74 mRNA序列（BT019505）为模板,设计分别含有BamH I、Sal I限制性酶切位点的上、下游特异性引物,从人外周血白细胞cDNA克隆sCD74基因;目的片段纯化后经BamH I、Sal I限制性双酶切,连接pQE-80L载体,经限制性酶切鉴定后送Ivitrogen公司进行测序分析;将测序正确的重组sCD74-pQE-80L质粒转化M15感受态细菌进行诱导表达;细菌经超声波破碎,离心取上清进行His亲和层析纯化,分梯度洗脱,收集各洗脱成分进行SDS-PAGE分析。通过上述实验克隆得到了人sCD74基因,原核表达产物His亲和纯化后纯度经SDS-PAGE测定约为95%。（2）sCD74与MIF结合的验证:采用半干转法将纯化的重组sCD74转移至PVDF膜,以鼠抗人CD74单克隆抗体（LN-2）及羊抗鼠IgG进行western blot分析,化学发光法检测结果;将MIF包被96孔ELISA平板,加入不同浓度重组sCD74,以鼠抗人CD74单克隆抗体（LN-2）及羊抗鼠IgG孵育后加OPD显色,450 nm测定OD值。原核表达sCD74经western blot验证正确;ELISA实验表明倍比稀释sCD74与MIF结合呈线性,R2=0.9925,证明了MIF与CD74结合的报道。2.DNA shuffling改组sCD74基因（1）人、小鼠、牛sCD74同源基因的克隆:对人、小鼠（NM010545）、牛（BT021489）CD74 cDNA序列进行生物信息学分析,确定人、小鼠、牛sCD74同源区,设计特异性引物从外周血白细胞cDNA模板克隆sCD74同源区DNA片段;将克隆得到三种同源基因DNA片段连接promega公司的pGEM-T载体,进行蓝白斑筛选,然后将经限制性内切酶切割鉴定的阳性克隆送Invitrogen公司进行测序分析。测序结果显示克隆得到的人、小鼠、牛sCD74基因片段正确。（2）人、小鼠、牛sCD74同源基因的定点突变:设计定点突变引物,采用交错延伸PCR将人、小鼠、牛sCD74同源基因内部的Hind III酶切位点（AAgCTT）突变为AAgCTg,突变产物连接promega公司pGEM-T载体,转化DH5α感受态进行蓝白斑筛选,然后将经限制性内切酶切割鉴定的阳性克隆送Ivitrogen公司进行测序分析。测序结果显示人、小鼠、牛sCD74基因内部Hind III酶切位点已被定点突变为AAgCTg。（3）随机小片段DNA的制备:将人、小鼠、牛同源sCD74 DNA片段按等摩尔比混合,以DNase I 37℃消化30 min,以2.0%琼脂糖凝胶电泳分析消化产物,切下30-50 bp大小的DNA片段,以B型小片段DNA高效回收试剂盒（博大泰克公司）回收。（4）DNA shuffling:首先进行无引物PCR,将回收的随机小片段DNA加入200μl微量离心管,加入dNTP、taq酶及缓冲液、Mg2+等,以ddH2O补足至20μl,反应20个循环,以2.0%琼脂糖凝胶电泳分析产物;向无引物PCR产物管中加入分别含有EcoR I、Hind III酶切位点的上、下游特异性引物,并按50μl体系补加dNTP、taq酶及缓冲液、Mg2+等,反应15个循环,以1.0%琼脂糖凝胶电泳分析产物,将500 bp左右片段切下回收。3.T7噬菌体展示文库的构建与筛选（1）T7噬菌体展示文库的构建:将回收的500 bp大小DNA片段以EcoR I、Hind III限制性内切酶切割,回收后以3:1摩尔比与T7Select?10-3b Cloning Kit （Novagen）试剂盒提供的T7Select 10-3 EcoR I/Hind III Vector Arm 16℃连接过夜;将5μl连接产物与25μl T7Select?biopanning kit （Novagen）试剂盒提供的T7 packaging extracts混合组装噬菌体（2平行管）;取5μl组装产物测定噬菌体文库原始容量。经测定,组装得到了一个容量为2.1×107 pfu的突变体原始文库。（2）淘洗法筛选高亲和力突变体噬菌体:将MIF以0.5μg/孔包被96孔ELISA平板,封闭后将原始噬菌体加入96孔板（2复孔）,室温作用30min后弃去孔内液体,以TBST洗涤3次,加洗脱液洗脱孔内结合的噬菌体,感染BLT5403宿主菌,扩增至OD600开始下降时止,测定扩增前后噬菌体滴度（pfu）;以重组sCD74封闭MIF后再加入噬菌体,逐步缩短突变体噬菌体与MIF作用的时间,同时逐步提高洗涤力度,延长洗脱时间,再进行3轮淘洗。经过四轮淘洗,噬菌体得到有效富集,第四轮淘洗克隆数为200,富集值为3.3×10-5。（3）高亲和力突变体噬菌体的鉴定:建立第四轮淘洗上清的噬菌体平板,选取噬菌斑数目约100个/板的平板,随机挑取40个单克隆,扩增后进行PCR鉴定阳性率;取PCR阳性的噬菌体与原核表达sCD74,以竞争ELISA测定单克隆突变体噬菌体抑制sCD74结合MIF的效果,PCR克隆3株高亲和力株所含的插入片段,送Ivitrogen公司测序。竞争性ELISA分析显示,高亲和力突变体噬菌体PHCD74mu具有体外抑制sCD74与MIF结合的作用（p<0.01）,且噬菌体与MIF的结合呈线性（R2=0.9905）;随机挑取的3个单克隆测序分析显示为相同克隆,命名此突变体为HCD74mu,是一个31氨基酸长度的短肽。4.高亲和力sCD74突变体（HCD74mu）的原核表达、纯化与鉴定（1）HCD74mu-pET42a表达载体的构建:以分别含有EcoR I、Hind III酶切位点的上、下游引物克隆HCD74mu编码基因,双酶切后连接pET42a载体,转化E.coli BL21,将PCR鉴定阳性的单克隆送Ivitrogen公司测序。测序结果显示,克隆正确。（2）HCD74mu的原核表达与纯化:将测序正确的HCD74mu-pET42a质粒转化BL21感受态细菌进行诱导表达,离心收集细菌进行超声破碎,离心取上清进行GST亲和层析纯化,以SDS-PAGE鉴定纯化产物。SDS-PAGE显示产物纯度约为95%。（3）竞争性ELISA鉴定重组HCD74mu抑制sCD74与MIF结合的效果:将MIF包被96孔ELISA平板,以竞争ELISA测定重组表达HCD74mu抑制sCD74结合MIF的效果。结果显示,重组HCD74mu具有显著的体外竞争性抑制sCD74与MIF结合的作用（p<0.01）,且不同浓度HCD74mu与MIF结合呈线性（R2=0.9969）。结论:本研究以人、小鼠、牛CD74胞外同源区基因为模板,组合利用DNA改组技术及T7噬菌体展示技术,构建了改组人sCD74 T7噬菌体展示文库,经过四轮筛选得到了一株高亲和力结合MIF的突变体HCD74mu;构建了HCD74mu的原核表达载体,诱导表达并进行了GST亲和层析纯化;经竞争性ELISA验证,HCD74mu具有在体外抑制MIF与CD74结合的能力。本研究为寻找一种具有临床治疗作用的MIF抑制剂奠定了基础,并初步探讨了从受体竞争角度进行疾病治疗的可能性,对相关研究具有重要意义。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 正文 基于DNA 改组的MIF 高亲和力受体突变体的筛选
• 前言
• 第一部分 sCD74 的原核表达与验证
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 DNA shuffling 改组sCD74 基因
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 T7 噬菌体展示文库的构建与筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 HCD74mu 的原核表达、纯化与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 蛋白质体外进化技术
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文