Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用

论文摘要

引言:T细胞在多种肝脏疾病的发病过程中具有重要作用,如病毒性肝炎,自身免疫性肝炎,酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病等,但是T细胞如何发挥作用及其相关细胞因子的信号调控机制仍不清楚。其中急性乙肝病毒（HBV）的清除和肝细胞的损伤是两个不同过程,HBV清除在肝细胞损伤前就已经完成,当特异性杀伤性T细胞（CTL）的缺乏导致病毒复制不能得到有效控制时,可引起大量非特异性炎性细胞,特别是非特异性CD8+T细胞在多种细胞因子的趋化作用下对肝组织的广泛浸润,这是造成肝组织大面积损伤的基础。为了深入研究T细胞应答在肝脏疾病中的作用机制,选择和应用与人类肝炎发病特征相类似的动物肝炎模型十分必要。注射刀豆蛋白A（Concanavalin A,ConA）诱发动物肝炎是一个已经建立完善的模型,这种模型的病理特征与人类病毒性肝炎,自身免疫性肝炎和药物性肝炎相似。ConA诱导的肝炎主要通过快速活化多克隆T细胞包括为CD4+T细胞、CD8+T细胞和NKT细胞来实现自身免疫损伤。其特征是血清谷丙转氨酶水平迅速升高,血清中含有大量细胞因子,肝脏出现白细胞浸润,肝细胞坏死和凋亡。在这种由ConA诱导的免疫系统过度活化所引起的肝脏急性损伤模型中,T细胞的激活依赖于Th1细胞因子IFNγ及其信号传导通路。研究表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号传递途径在肝脏先天抗病毒防御系统、急性期反应、肝脏损伤与修复中均起着重要作用。Spred（Sprouty相关的蛋白激酶异构体-1（EVH-1）domain）蛋白家族是一组与Sprouty相关的酪氨酸激酶结合蛋白,是重要的负调控因子,能够抑制生长因子诱导的胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）的活化从而下调Ras-ERK-MAPK信号通路。鉴于MAPK通路在肝脏生物学中的作用,由此推断Spred可能在T细胞介导的肝脏损伤中发挥重要作用。通过Northern杂交检测小鼠各组织中的mRNA,发现Spred-2在全身各处均有表达,Spred-1仅分布于心、脑、肾、结肠等,而Spred-3特异地表达于脑组织中。课题组之前利用DNA同源重组技术和胚胎干细胞（ES细胞）发育全能性的原理,定点改变小鼠基因组的序列和结构,获得特定基因（基因组）即Spred-2被修饰的遗传性小鼠突变模型。因此本课题将应用基因敲除技术构建的动物模型对Spred-2在T细胞介导的肝脏损伤的调控机制进行深入研究,为肝炎的治疗提供新的思路和启发。目的:探讨Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用。方法:雌性68周C57BL/6J（WT）小鼠和Spred-2基因敲除（Spred-2 KO）小鼠,单次静脉注射ConA（15 mg/kg体重）后,6h、12h、24h麻醉后处死。血浆液氮冻存,肝脏生理盐水冲洗后,一部分液氮冻存,一部分10%中性甲醛固定,另一部分0.25%胶原酶消化后分离肝脏白细胞。生化法测定血清谷丙转氨酶浓度;试剂盒比色法测定caspase-3,8,9含量,ELISA法测定血清IFNγ浓度;应用流式细胞仪测定肝脏T细胞和NKT细胞数目;Real time PCR测定CXCL9/10,CXCR3受体,Perforin,Fas,TNF-α,IL-17 mRNA水平。结果:ConA注射12小时后,Spred-2 KO小鼠肝脏损伤较WT小鼠严重,血清谷丙转氨酶（7476.20±1387.54 IU/L vs. 3752.63±803.36 IU/L, P < 0.05）浓度升高;Caspase-3,-8,-9相对值为（63.78±11.90 vs. 17.35±4.48, P < 0.05; 48.21±7.62 vs. 8.89±1.92, P < 0.05;48.07±7.39 vs. 8.23±2.36, P < 0.05）活性增加;血清IFNγ（1.89±0.18 ng/ml vs. 0.81±0.22 ng/ml, P < 0.05）浓度升高,肝脏IFNγ相对值（2.57±0.49 vs. 1.40±0.25, P < 0.05）水平提高;流式细胞术发现,Spred-2 KO小鼠肝脏CD8+T细胞数量显著增加（8.41±2.13 105/ml vs. 5.15±1.18 105/ml, P < 0.05）,CD4+T细胞和NKT细胞数量与WT小鼠无显著差异;CXCL9/10,CXCR3受体,Perforin ,Fas表达水平提高。结论:1、肝细胞损伤程度在具有Spred-2基因的野生型小鼠中较轻,肝细胞凋亡较少,提示Spred-2基因可能发挥肝细胞保护作用。2、在小鼠急性肝炎过程中,包含Spred-2基因的野生型小鼠可能通过抑制Th1细胞的反应,降低炎症反应和趋化因子的水平来发挥肝细胞保护作用的。3、Spred-2基因在ConA诱导的小鼠肝炎中的起到一定的保护作用,可能成为T细胞诱导肝脏损伤新的治疗靶点。

论文目录

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