草莓果实磷酯酶D生理生化及分子生物学特性研究

论文题目: 草莓果实磷酯酶D生理生化及分子生物学特性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 袁海英

导师: 陈力耕

关键词: 草莓,果实,磷脂酶,活性,免疫杂交,酶动力学,荧光标记,吲哚乙酸,亚细胞学,免疫定位,序列分析

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 草莓(Fragaria ananassa Duch.)是一种经济价值很高的速生草本果树,国内草莓果实的总产量从1998年到2004年六年间翻两番。随着我国加入WTO,果品市场已形成竞争更为激烈的局面。人们对水果品质的要求不断提高,高品质水果的生产已成为我国果业与国际市场接轨的关键。由于草莓果实柔软多汁,缺乏坚硬的保护性外皮;且草莓的成熟期短,成熟过程中品质转化快,加上其外果皮极薄,草莓果实在采后运输、储藏及销售过程中易于遭受生理伤害和病菌侵袭而导致腐烂变质,货架期短;其中细胞壁及细胞膜结构的降解代谢促进了这一过程。细胞膜结构的保持和细胞内区域化结构的完整有助于保持果实的采后品质,磷脂酶D活性的调节在其中起重要作用;然而对于磷脂酶D在草莓果实中的作用却未见相关报道。因此,通过对草莓果实发育成熟过程中磷脂酶D的代谢、调控及分子生物学研究,可为明确磷脂酶D在草莓果实发育成熟过程中的作用机理打下基础,从而有助于设计和提出减少细胞膜伤害、提高草莓采后品质、延长草莓采后储藏期的合适的采收、运输及储藏条件和新方法;与此同时,本研究也有助于了解在非跃变型果实草莓中磷脂酶D在信号传导过程中所起的作用。本研究以草莓品种Aromas利Seascape为试材,对草莓果实不同发育时期磷脂酶D的活陆变化、磷脂酶D的生化特性、活体条件下磷脂酶D的特性,磷脂酶D的亚细胞学定位及分子生物学特性等进行了初步研究,主要研究结果如下: (1) 磷脂酶D活性测定体系的建立在磷脂酶D生理生化特性的研究中起重要的作用。以草莓果实为试材,优化了磷脂酶D活性测定的底物放射标记法,建立了适合草莓果实组织磷脂酶D制备及活性测定的技术体系:该技术体系的建立为后续进一步探讨磷脂酶D在草莓果实发育成熟和衰老进程中的作用奠定基础。 (2) 对草莓果实不同发育时期磷脂酶D活性进行的测定发现,除白果期外,‘Seascape’品种在其他发育阶段的磷脂酶D活性总体上都要高于‘Aromas’品种。‘Aromas’品种线粒体膜磷脂酶D的活性在果实发育的各个阶段变化不人;微粒体膜磷脂酶D的活性随着果实的发育逐渐升高,并在白果期达到最高。‘Seascape’品种微粒体膜磷脂酶D的活性在幼果期最高,之后则迅速下降至其起始水平的一半左右;而其线粒体膜磷脂酶D的活性在绿果期至绿果膨大期间下降,之后呈增强趋势,并在转色期达到最高。草莓果实发育和成熟阶段膜磷脂酶D活性的变化说明草莓果实的发育成熟与膜磷脂酶D活性之间存在相关性。 (3) 不同发育时期草莓果实磷脂酶D蛋白免疫杂交的结果与活性测定结果呈现出相似的变化趋势;杂交结果显示磷脂酶D蛋白的分子量约为92kDa。 (4) 对草莓果实不同组分磷脂酶D生化特性的研究结果发现,线粒体膜磷脂酶D的适宜pH条件为5.5和6.5,微粒体膜磷脂酶D的适宜pH条件为5和7:酶动力学分析认为,

论文目录:

缩略语表

中文摘要

第一章文献综述

1 植物磷脂酶D研究回顾

1.1 磷脂酶D催化的酶反应

1.2 磷脂酶D产物的代谢趋势

1.3 植物中的磷脂酶D

1.4 磷脂酶D的特性

1.4.1 磷脂酶D的底物特异性

1.4.2 磷脂酶D的分布和细胞内定位

1.4.3 磷脂酶D的活性受Ca~(2+)调控

1.4.4 磷脂酶D的活性受pH值调控

1.4.5 肌醇磷脂类对磷脂酶D活性的调控

1.4.6 膜组成及生理状态对磷脂酶D活性的调控

1.4.7 G蛋白对磷脂酶D活性的调控

1.5 信号传导途径及植物生长发育过程中的磷脂酶D

1.5.1 植物体内的信号传导途径

1.5.2 磷脂酶D产生的脂类中介体及其功能

1.5.3 磷脂酶D与其它信号传导途径的互作

1.5.4 植物激素作用和信号传导过程中的磷脂酶D

1.5.5 植物胁迫反应和信号传导过程中的磷脂酶D

1.5.6 植物衰老过程中的磷脂酶D

1.6 磷脂酶D的分子生物学研究

1.6.1 不同磷脂酶D的克隆和序列比对

1.6.2 磷脂酶D的基因结构及表达

1.6.3 磷脂酶D蛋白的结构

1.6.3.1 HKD结构域

1.6.3.2 C2结构域

1.6.3.3 磷脂酰肌醇二磷酸(PIP_2)结合域

1.6.3.4 ‘IYIENQFF’区域

1.6.3.5 PX结构域

1.6.3.6 PH结构域

2 草莓果实发育成熟过程的主要调控因素

2.1 草莓果实发育成熟过程中的激素调控

2.1.1 生长素、赤霉素及细胞分裂素与草莓果实的发育成熟

2.1.2 乙烯与草莓果实的发育成熟

2.2 草莓果实发育成熟过程与胞壁降解酶的关系

2.2.1 草莓果实软化的过程

2.2.2 细胞壁酶与果实软化之间的关系

2.2.2.1 多聚半乳糖醛酸酶

2.2.2.2 纤维素酶

2.3 草莓果实发育成熟过程与脂肪氧合酶的关系

2.3.1 脂肪氧合酶在果蔬成熟衰老中的作用

2.3.1.1 调节成熟过程中某些物质的合成

2.3.1.2 控制果蔬的成熟与衰老

2.3.1.3 提高果蔬的抗性

2.3.2 脂肪氧合酶与草莓果实的成熟和衰老

2.4 草莓果实发育成熟过程与Ca~(2+)的关系

2.4.1 钙与果实采后贮藏生理关系

2.4.2 Ca~(2+)与草莓果实的成熟衰老

3 本研究的意义及研究内容

3.1 研究意义

3.2 研究内容

第二章草莓果实磷脂酶D制备及活性测定体系的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 仪器及数据处理方法

1.3 方法

1.3.1 不同pH缓冲液的配置

1.3.2 草莓果实磷脂酶D的制备

1.3.3 磷脂酶D活性测定底物的制备

1.3.4 草莓果实磷脂酶D活性的测定

2 结果与分析

2.1 草莓果实磷脂酶D的制备方法

2.2 蛋白含量对草莓果实磷脂酶D活性的影响

2.3 反应时间对草莓果实磷脂酶D活性的影响

2.4 pH条件对草莓果实磷脂酶D活性的影响

3 讨论

第三章草莓果实不同发育时期磷脂酶D的活性变化及免疫杂交

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 不同发育时期草莓果实磷脂酶D的制备

1.2.2 不同发育时期草莓果实磷脂酶D活性的检测

1.2.3 不同发育时期草莓果实磷脂酶D的免疫杂交方法

2 结果与分析

2.1 不同发育时期草莓果实磷脂酶D活性的变化

2.2 不同发育时期草莓果实磷脂酶D的免疫杂交

3 讨论

第四章草莓果实磷脂酶D生化特性的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 不同浓度CaCl_2、CaM及底物的配置

1.2.2 草莓果实磷脂酶D的制备

1.2.3 磷脂酶D活性的检测

2 结果与分析

2.1 草莓果实磷脂酶D的酶动力学分析

2.2 钙离子对草莓果实磷脂酶D活性的影响

2.3 钙调素对草莓果实磷脂酶D活性的影响

3 讨论

第五章活体条件下草莓果实磷脂酶D特性的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 草莓果实原生质体的制备

1.2.2 原生质体的荧光标记及共聚焦荧光显微成像

2 结果与分析

2.1 草莓果实原生质体BODIPY-PC荧光标记的不同模式

2.2 草莓果实原生质体中Ca~(2+)对磷脂酶D作用的影响

2.3 草莓果实原生质体中IAA对磷脂酶D作用的影响

2.4 IAA对草莓果实细胞内Ca~(2+)水平的影响

3 讨论

第六章草莓果实不同发育时期磷脂酶D的亚细胞学定位

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 草莓果实组织的处理及电镜观察

2 结果与分析

2.1 草莓果实磷脂酶D免疫金亚细胞学定位技术的优化

2.2 草莓果实发育初期磷脂酶D的亚细胞学定位

2.3 草莓果实发育后期磷脂酶D的亚细胞学定位

3 讨论

第七章草莓果实磷脂酶D α的全长cDNA克隆和磷脂酶 D α蛋白结构功能预测

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 简并引物的设计

1.2.2 草莓RNA的提取

1.2.3 草莓磷脂酶D的RT-PCR及片段测序

1.2.4 草莓磷脂酶D的3’-RACE

1.2.5 草莓磷脂酶D的5’-RACE

1.2.6 计算机预测分析和分子进化分析

2 结果与分析

2.1 草莓磷脂酶Dα cDNA全序列的克隆

2.2 草莓磷脂酶Dα的序列分析

2.3 草莓磷脂酶Dα二级结构及功能预测分析

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

与本论文相关已发表或待发表文章

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].草莓CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系建立和FaMAPK12基因功能分析[D]. 邢思年.中国农业大学2018
[2].草莓匍匐茎发生基因的定位克隆与鉴定[D]. 李伟佳.沈阳农业大学2018
[3].钾离子通道FaTPK1基因在草莓果实成熟和品质形成中的功能研究[D]. 王树芳.中国农业大学2018
[4].FaSnRK2.6/FaMPK3信号系统在草莓果实发育和成熟中的作用及机理分析[D]. 韩瑜.中国农业大学2015
[5].蔗糖及茉莉酸信号在草莓果实发育中的作用及其机理分析[D]. 贾海锋.中国农业大学2013
[6].色氨酸对草莓离体培养与生长发育的调控机理研究[D]. 钟晓红.湖南农业大学2004
[7].草莓对盐胁迫的反应及调控研究[D]. 李青云.河北农业大学2005
[8].草莓的光抑制特性及光质对其生长结果的影响[D]. 徐凯.浙江大学2005
[9].草莓果实膜联蛋白基因的cDNA克隆及其遗传转化的研究[D]. 杨怀义.沈阳农业大学1999
[10].一氧化氮对草莓和肥城桃果实成熟衰老的调控机理研究[D]. 朱树华.山东农业大学2006

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