ChREBP和ACC1在肝细胞糖/脂代谢调控中的作用

论文摘要

在整个生物体能量平衡中肝脏代谢调控系统起着关键作用,因为肝脏是糖代谢（糖酵解和肝糖原合成）和甘油三脂合成（脂肪生成）的主要部位。脂肪生成会受到关键酶的调控,这些酶的活性依靠变构和共价修饰产生。大部分糖酵解和脂肪生成过程中的酶的合成会受到进食状况的调控,其中葡萄糖是起到至关重要作用的营养物质。葡萄糖主要作用于编码这些酶的基因的转录调控过程。糖应答元件结合蛋白（ChREBP）和乙酰辅酶A羧化酶（ACCs）是糖／脂代谢过程中两个重要因子。ChREBP是碱性／环-螺旋-环／亮氨酸拉链（bHLH/LZ）转录因子家族成员,在肝脏内大量表达的。它在进食高碳水化合物食物后会高效表达,而在进食高脂类食物后其表达会受到抑制。它对很多脂酶有调控作用。同时,ChREBP的活性又会被胰岛素、葡萄糖和抗糖尿病类药物的调节。因此,研究ChREBP的作用机理有着重要的意义。ACCs家族目前发现的有两个成员：ACC1和ACC2。ACC1主要是在肝脏和脂肪组织的细胞质中表达；ACC2主要是在心脏和肌肉组织的线粒体中表达。ACCs是ChREBP的靶基因之一,会受到食物、激素和其他一些生理因子的调控。本研究采用real-time PCR和细胞转染等技术,对猪ChREBP基因的生物学特性,ChREBP的功能和转录水平的表达调控,ACC1转录水平的表达调控等进行了研究,获得如下结果：1.通过同源分析比较,以小鼠和人的ChREBP基因序列为参照,运用RT-PCR方法,获得了猪ChREBP基因；以猪的心、肝、脾、和肺等11个组织样品作为研究材料,通过半定量RT-PCR分析获得了ChREBP的组织表达谱；通过辐射杂种板分析进行了ChREBP的染色体定位,并与人的定位结果进行了比较。2.在无血清无糖培养条件下,对HepG2人肝癌细胞系进行葡萄糖和胰岛素的时间和梯度刺激。采用real-time PCR方法,检测了ChREBP、胆固醇应答元件结合蛋白（SREBP-1c）.ACC1和脂肪酸合成酶（FAS）mRNA的表达量。结果表明,葡萄糖在单独作用时也可引起ChREBP.SREBP-1c.ACC1和FAS表达量的升高。3.以RT-PCR的方式,克隆得到ChREBP和SREBP-1c的编码序列,分别构建真核表达载体。通过转染和共转染,研究ChREBP和SREBP-1c对靶基因（ACC1）的调控作用。结果表明,ChREBP和SREBP-1c并无协同作用,相反它们有可能对靶基因启动子区的调控位点有竞争作用。4.在游离脂肪酸的作用下,细胞中ChREBP和SREBP-1c mRNA的表达量下降,而ACC1的表达量却在花生四稀酸存在的情况下大幅度升高。相关因子肝脏X蛋白受体（LXR）和过氧化酶增值体激活受体（PPARa）在花生四稀酸的作用下表达量无明显变化,但cAMP应答元件结合蛋白1 （CREB1）的表达量有所增高。这表明,花生四稀酸不是通过已知两条糖／脂代谢途径来诱导ACC1表达的。5.检测花生四稀酸诱导或转染CREB1后的细胞培养液中的葡萄糖含量和细胞中甘油三酯的含量,同时通过real-time PCR,检测了细胞中葡萄糖吸收和脂肪酸合成的标志性基因——葡萄糖转运蛋白2 （GLUT2）,葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）和FAS的表达量。综合以上结果,表明花生四稀酸对ACC1的诱导会引起细胞中甘油三酯的沉积,但对葡萄糖的摄取没有明显影响。6.构建CREB1的真核表达载体及ACC1的启动子荧光素酶载体,进行转染和共转染。通过real-time PCR检测转染CREB1的细胞中ChREBP, SREBP-1c和ACC1的表达量。在共转染后,检测荧光素酶的活性,观察ACC1启动子活性的变化。结果表明,CREB1可结合到ACC1的PⅡ启动子上。这与花生四稀酸的诱导实验的结果相同,进一步证实花生四稀酸是通过CREB1来调控ACC1的表达的。这一作用可能与前列腺素（PG）途径相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 肝脏中的糖/脂代谢
• 1.1 概述
• 1.2 糖代谢
• 1.2.1 糖酵解
• 1.2.2 肝糖原合成与分解
• 1.3 脂代谢
• 1.3.1 脂肪酸合成
• 1.3.2 脂肪酸氧化
• 1.4 糖代谢与脂代谢的相互关系
• 2 糖/脂代谢相关因子
• 2.1 过氧化酶增值体激活受体
• 2.2 胆固醇应答元件结合蛋白
• 2.3 cAMP应答元件结合蛋白
• 2.4 脂肪酸合成酶
• 2.5 葡萄糖转运蛋白
• 3 糖应答元件结合蛋白
• 3.1 ChREBP的发现
• 3.2 ChREBP的结构生物学
• 3.3 糖/脂代谢中ChREBP的作用
• 3.3.1 ChREBP在葡萄糖代谢中的作用
• 3.3.2 ChREBP对的脂酶的调控作用
• 3.4 ChREBP蛋白的调控
• 3.4.1 ChREBP表达的调控
• 3.4.2 ChREBP活性的调控
• 4 乙酰辅酶A羧化酶
• 4.1 ACCs在脂肪酸合成和氧化中的作用
• 4.2 ACCs基因表达及功能的调控
• 4.3 ACCs基因启动子区域分析
• 5 游离脂肪酸对糖/脂代谢途径的影响
• 5.1 概述
• 5.2 不饱和脂肪酸的调控作用
• 5.2.1 PUFAs对SREBP-1c基因的调控作用
• 5.2.2 PUFAs对ChREBP基因的调控作用
• 5.3 花生四稀酸的调控作用
• 5.3.1 花生四烯酸在炎症中的作用
• 5.3.2 花生四烯酸在糖/脂代谢中的作用
• 第二章 猪CHREBP基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析
• 1 前言
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 样品采集
• 2.1.3 菌株及质粒
• 2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要溶液配制
• 3 实验方法
• 3.1 组织样品总RNA提取
• 3.2 总RNA纯化
• 3.3 总RNA纯度鉴定
• 3.4 目标片段的扩增与纯化
• 3.4.1 ChREBP扩增引物
• 3.4.2 ChREBP的扩增
• 3.4.2.1 片段的扩增
• 3.4.2.2 PCR产物的检测、纯化、克隆与测序
• 3.5 ChREBP的组织表达谱分析
• 3.5.1 模版的准备
• 3.5.2 引物设计
• 3.5.3 PCR扩增指数期循环数的确定
• 3.5.4 半定量分析
• 3.5.5 数据统计分析
• 3.6 ChREBP的染色体定位
• 3.6.1 ChREBP内含子的扩增
• 3.6.2 定位所用引物的设计
• 3.6.3 PCR扩增分型方法
• 3.6.4 数据分析方法
• 4 结果
• 4.1 猪ChREBP的克隆
• 4.2 猪ChREBP基因的组织表达谱分析
• 4.3 猪ChREBP基因的染色体定位
• 4.5 猪ChREBP基因与人、小鼠和大鼠基因的同源性对比
• 5 讨论
• 第三章 葡萄糖和胰岛素对CHREBP表达的调控
• 1 前言
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 实验细胞
• 2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
• 3 实验方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 细胞诱导培养
• 3.3 细胞RNA提取和纯化
• 3.4 Real-time PCR
• 3.4.1 检测引物的设计
• 3.4.2 Real-time PCR扩增条件
• 3.5 数据统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 葡萄糖对ChREBP的调控
• 4.1.1 基因对葡萄糖的浓度依赖性
• 4.1.2 基因对葡萄糖的时间依赖性
• 4.2 胰岛素对ChREBP的调控
• 4.2.1 基因对胰岛素的浓度依赖性
• 4.2.2 基因对胰岛素的时间依赖性
• 5 讨论
• 第四章 ACC1启动子活性及其调控
• 1 前言
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 实验细胞
• 2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
• 3 实验方法
• 3.1 转录因子真核表达载体的构建
• 3.2 组织总蛋白的提取
• 3.3 Western blotting
• 3.4 ACC1启动子序列真核表达载体的构建
• 3.5 质粒的大量提取
• 3.6 质粒浓度和纯度检测
• 3.7 细胞培养
• 3.8 细胞转染
• 3.9 细胞RNA提取和纯化
• 3.10 Real-time PCR
• 3.11 双荧光素酶报告基因检测
• 3.12 数据统计分析
• 4 结果
• 4.1 转录因子真核表达载体的构建
• 4.2 ChREBP和SREBP-1c基因在HepG2细胞中超表达
• 4.3 ChREBP和SREBP-1c对靶基因表达的影响
• 4.4 ACC1变体蛋白的检测
• 4.5 ACC1启动子区的真核表达载体的构建
• 4.6 转录因子对ACC1启动子活性的影响
• 4.6.1 转录因子对ACC1 PⅠ启动子活性的影响
• 4.6.2 转录因子对ACC1 PⅡ启动子活性的影响
• 5 讨论
• 第五章 CREB1介导花生四烯酸对ACC1表达的调控作用
• 1 前言
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 实验细胞
• 2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
• 3 实验方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 细胞诱导培养
• 3.3 细胞RNA提取和纯化
• 3.4 表达载体和启动子载体的构建
• 3.5 质粒的大量提取
• 3.6 质粒浓度和纯度检测
• 3.7 Real-time PCR
• 3.7.1 基因检测引物的设计
• 3.7.2 Real-time PCR扩增条件
• 3.8 培养液中葡萄糖含量的检测
• 3.9 细胞中甘油三酯（TG）含量的检测
• 3.10 数据统计分析
• 4 结果
• 4.1 游离脂肪酸对ACC1基因的表达影响
• 4.2 花生四烯酸对ACC1基因表达的影响
• 4.3 花生四稀酸对相关调控因子表达的影响
• 4.4 CREB1在HepG2细胞中超表达
• 4.5 CREB1对ACC1表达的调控作用
• 4.6 花生四烯酸和CREB1对糖/脂代谢相关因子的影响
• 4.7 ACC1启动子对花生四烯酸的应答作用
• 5 讨论
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录