桃脂氧合酶（LOX-3）基因的表达分析

论文摘要

以桃栽培品种“瑞蟠四号”、“加纳岩”和“华玉”果实为试材,研究了桃脂氧合酶基因家族成员PpLox-3基因在原核细胞中的表达,在洋葱表皮细胞中的定位,以及不同处理方式下PpLox-3基因表达量及其与成熟软化相关指标的相关性分析,以期明确PpLox-3的表达特性及其在桃果实成熟软化和乙烯信号转导中的作用,主要试验结果如下:1.PpLOX-3开放阅读框ORF全长与原核表达载体pET-32a（+）相连接,构建重组原核表达载体pET-LOX-3,并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在20℃条件下,IPTG浓度在0.6mmol/L时表达量最大,在37℃条件下,IPTG浓度为1.0mmol/L时,表达量最大。通过SDS-PAGE电泳,得到一条约125kD的融合蛋白条带,除去pET-32a（+）自身诱导的约20kD大小的蛋白后,结果与PpLOX-3编码的约105kD蛋白的大小一致,证明PpLOX-3是大小为105kD的蛋白。2.通过生物信息学分析表明,PpLOX-3基因编码的蛋白相对分子质量为105870.2 D,分子式为C4780H7443N1271O1385S31,等电点pI为6.37,属于不稳定的水溶性蛋白,在整个蛋白中,螺旋占到30.76%、直连占10.61%、环占58.63%,结果还显示该蛋白可能定位于细胞质膜中。通过构建了以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达载体163Gpp-PpLOX-3,通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。结果表明PpLOX-3定位在洋葱表皮细胞的细胞质膜中,属于膜蛋白。3.通过对加纳岩和华玉桃果实在采收后的不同处理,发现机械损伤和MeJA处理能够提前乙烯释放量高峰的时间,但不增加乙烯的释放量,同时能够增强ACO的活性,并能够诱导PpLOX-3基因的表达;SA处理可以明显的推迟乙烯释放量高峰期,同时不增强ACO的生物活性,并抑制PpLOX-3基因的表达。上述结果表明,桃脂氧合酶（PpLOX3）为大小105kD,不稳定的水溶性蛋白,位于细胞质膜等生物膜中,属于膜蛋白,并且在桃果实成熟软化过程中起到一定的作用,与果实的成熟软化相关连。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂氧合酶研究现状
• 1.1.1 LOX 的基本特征
• 1.1.2 LOX 国内外研究现状
• 1.1.3 LOX 与果实成熟软化的关系
• 1.2 表达分析研究方法
• 1.2.1 原核表达
• 1.2.2 亚细胞定位
• 1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）
• 1.3 本研究的目的及意义
• 第二章 桃脂氧合酶基因的原核表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PpLOX-3 基因ORF 的PCR 扩增
• 2.2.2 PpLOX-3 基因编码蛋白的理化性质与结构预测
• 2.2.3 原核表达载体的构建与鉴定
• 2.2.4 PpLOX-3 基因重组蛋白的SDS-PAGE 分析
• 2.3 讨论
• 第三章 PpLOX-3 的亚细胞定位表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目的片段的克隆与鉴定
• 3.2.2 植物表达载体的构建与鉴定
• 3.2.3 生物信息学分析预测
• 3.2.4 PpLOX-3 蛋白在洋葱表皮中的定位
• 3.3 讨论
• 第四章 脂氧合酶与桃成熟软化的关系
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 果实贮藏和处理
• 4.1.3 乙烯释放量和果实硬度的检测
• 4.1.4 ACC 氧化酶（ACO）活性测定
• 4.1.5 PpLOX-3 基因相对表达量的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 机械损伤、MeJA 和 SA 对乙烯释放速率的影响
• 4.2.2 机械损伤、MeJA 和 SA 对果实硬度变化的影响
• 4.2.3 机械损伤、MeJA 和 SA 对 ACO 活性变化的影响
• 4.2.4 机械损伤、MeJA 和 SA 对 PpLOX-3 基因相对表达量的影响
• 4.2.5 PpLOX-3 基因相对表达量与各指标间相关性分析
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介