兴凯湖翘嘴鲌肌肉品质及相关候选基因研究

论文摘要

兴凯湖翘嘴鲌（Culter alburnus in Xingkai Lake）又名兴凯湖大白鱼,其肉色亮白如玉,肉质细嫩鲜美,是我国四大淡水名鱼之一,具有很高的经济价值。近年来,由于过度捕捞及产卵场环境恶化,野生兴凯湖大白鱼已日渐濒危,人工养殖应运而生。但在人工养殖条件下,由于片面追求高生长速度、高产量,养殖群体的肉质风味急剧下降,失去了野生大白鱼的鲜嫩口感,导致其价格远低于野生群体,严重影响了经济效益。本研究针对这一问题,以兴凯湖翘嘴鲌为试验对象,采用常规分析方法测定并比较不同年龄兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉物理指标（pH值、肉色和质构特性）、常规营养指标、氨基酸含量、脂肪酸含量、部分血液生化指标和组织学特征,对其肌肉品质进行初步评定。采用生物化学和分子生物学的方法,利用RACE和RT-PCR等技术,克隆与肉质相关的重链肌球蛋白基因（MYHs）、生肌分化因子（MyoD）、肥胖基因产物（Leptin）和钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）,并对基因的结构和功能进行解析；采用Real Time PCR技术,从mRNA水平研究上述基因在不同年龄野生与养殖群体表达差异,探索基因表达与肉质性状之间的关系,从分子水平对肌肉品质差异的形成进行初步分析。试验结果如下：1.从2龄后野生兴凯湖翘嘴鲌肌肉pH值均显著高于养殖群体,L*和b*值均显著高于养殖群体,a*值显著低于养殖群体（P<0.05）,肉色更加洁白,晶莹剔透。兴凯湖翘嘴鲌野生群体硬度、弹性、回复性等方面高于养殖群体（P<0.05）,肌肉口感更好。兴凯湖翘嘴鲌野生和养殖群体的肌纤维基本结构相同,均为不规则多边形,但野生群体比养殖群体的肌纤维直径更小,肌纤维密度更大（P<0.05）。这说明在肌肉物理特性和组织学特征方面,野生兴凯湖翘嘴鲌肉质表现更为优异。2.2龄野生和养殖群体兴凯湖翘嘴鲌肌肉常规营养成分含量无显著差异（P>0.05）；4龄、6龄野生翘嘴鲌肌肉水分和粗蛋白含量显著高于养殖群体（P<0.05）,脂肪含量明显低于养殖群体（P<0.05）。野生兴凯湖翘嘴鲌钙和磷含量比一般常见养殖鱼类高。野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌的氨基酸组成一致,甘氨酸（Gly）含量最高,谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys）次之。野生兴凯湖翘嘴鲌氨基酸总量、必需氨基酸总量和鲜味氨基酸含量明显高于养殖群体（P<0.05）。说明野生兴凯湖翘嘴鲌食用价值和肉味鲜美程度明显优于养殖群体,且随年龄增长愈加明显。3.野生兴凯湖翘嘴鲌与养殖群体脂肪酸组成一致,以油酸（C18：1）、亚油酸（C18:2n-6）和棕桐酸（C16：0）为主。但其多不饱和脂肪酸（PUFA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）总量显著高于养殖群体（P<0.05）。这也是兴凯湖翘嘴鲌野生群体肉质风味和营养保健功能优于养殖群体的重要原因之一。兴凯湖翘嘴鲌野生群体血清中的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖（Glu）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量明显低于养殖群体,高密度脂蛋白（HDLC）含量高于养殖群体,说明野生兴凯湖翘嘴鲌的能量代谢正常,血脂水平较低,体现了血脂和体脂的正相关,从而表现出更优良的健康水平。4.克隆分离出兴凯湖翘嘴鲌MYHs两个亚型（MYHa和MYHb）,其中MYHa cDNA全长6003bp,开放阅读框（ORF）长5802bp,编码1933个氨基酸；MYHb cDNA全长为5990bp,开放阅读框为5793bp,编码1930个氨基酸。将其提交到Genbank上,其登录号分别为JX272926和JX402919。通过比对,这两个基因同源性低（73%）,且3’非翻译区有很大的差异,因此,这是一个基因的两个同型异构体,既是结构蛋白又是功能蛋白。MYHa和MYHb分别与鲢（Hypophthalmichthys molitrix）快速骨骼肌MYH typel型和MYH type3型同源性最高,分别为98%和97%,与其他鱼类同源性达到90%以上,说明兴凯湖翘嘴鲌MYHs具有较高的保守性。5.克隆分离兴凯湖翘嘴鲌MyoD基因,其cDNA全长1096bp,开放阅读框为828bp,编码275个氨基酸,将其提交到Genbank上,其登录号分别为KC782835。通过对其结构分析发现,该氨基酸具有该家族的典型结构域碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）,其中1-84个氨基酸为碱性区域,第98-141个氨基酸为螺旋环螺旋（HLH）结构。兴凯湖翘嘴鲌MyoD与草鱼同源性最高,达99.3%,与哺乳动物相比也有大于60%的同源性,说明兴凯湖翘嘴鲌MyoD相当保守。6.克隆分离兴凯湖翘嘴鲌肥胖基因产物Leptin,其cDNA全长1208bp,开放阅读框522bp,编码173个氨基酸,将其提交到Genbank上,其登录号为KC782834。分析表明翘嘴鲌LeptinN端第20-21位为酶切位点,形成信号肽。7.克隆分离出兴凯湖翘嘴鲌CAST部分序列共1997bp。通过NCBI Blast在线分析软件比对,结果发现该序列与己公布的斑马鱼和草鱼CAST相似性分别为90%和83%,说明CAST基因相对保守。8.对不同时期野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织MYHs、MyoD、Leptin和CAST基因的表达研究表明,从2龄到6龄,野生群体MYHa表达量明显低于养殖群体（P<0.05）, MYHb明显高于养殖群体,鱼体越大差异越明显,两种基因型共同作用影响肉质性状。从2龄后MyoD基因表达呈现出上调趋势,Leptin基因表现出下调性表达,而CAST基因下调趋势从4龄开始明显。因此,MYHs和MyoD是控制肌肉发育的主效基因,Leptin基因与机体脂肪代谢有关,推测CAST基因不是影响鱼肉嫩度形成的唯一主效基因,可能更多的是与钙蛋白酶系统其它基因一起参与调控肌肉的嫩度。

论文目录

• CONTENTS
• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 兴凯湖翘嘴鲌概况
• 1.1.1 兴凯湖翘嘴鲌生物学特性
• 1.1.2 兴凯湖翘嘴鲌资源现状与养殖现状
• 1.1.3 兴凯湖翘嘴鲌研究进展
• 1.2 鱼类肉质评价指标
• 1.2.1 感官指标
• 1.2.2 技术指标
• 1.2.3 营养指标
• 1.2.4 卫生指标
• 1.3 肉质相关候选基因研究进展
• 1.3.1 重链肌球蛋白MYHs研究进展
• 1.3.2 生肌分化因子MyoD基因研究进展
• 1.3.3 肥胖基因产物Leptin研究进展
• 1.3.4 钙蛋白酶抑制蛋白CAST研究进展
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验鱼
• 2.2 样品的采集与处理
• 2.3 实验试剂和仪器
• 2.4 检测项目与方法
• 2.4.1 肌肉物理指标测定
• 2.4.2 肌肉常规营养成分分析
• 2.4.3 氨基酸分析
• 2.4.4 脂肪酸组成分析
• 2.4.5 血液部分生化指标测定
• 2.4.6 肌肉组织学分析
• 2.4.7 相关肉质基因克隆与序列分析
• 2.4.8 相关肉质基因表达分析
• 2.5 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉物理特性比较
• 3.1.1 pH值和肉色比较
• 3.1.2 质构特性比较
• 3.2 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉常规营养成分比较
• 3.3 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉氨基酸分析
• 3.3.1 氨基酸组成及含量
• 3.3.2 不同年龄野生与养殖群体肌肉营养品质评价
• 3.4 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体脂肪酸组成与含量
• 3.5 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体部分血清生化指标比较
• 3.6 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉组织学观察及测量
• 3.7 兴凯湖翘嘴鲌肉质相关候选基因克隆与序列分析
• 3.7.1 组织总RNA提取结果
• 3.7.2 兴凯湖翘嘴鲌重链肌球蛋白MYHs克隆与分析
• 3.7.3 兴凯湖翘嘴鲌生肌分化因子（MyoD）克隆与分析
• 3.7.4 兴凯湖翘嘴鲌肥胖基因（Leptin）克隆与分析
• 3.7.5 兴凯湖翘嘴鲌钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）部分序列克隆
• 3.8 野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌肉质相关候选基因表达比较
• 3.8.1 不同年龄野生与养殖群体肌肉总RNA提取与检测
• 3.8.2 标准曲线制作
• 3.8.3 野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌MYHs表达量比较分析
• 3.8.4 野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌MyoD表达量比较分析
• 3.8.5 野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌Leptin表达量比较分析
• 3.8.6 野生与养殖群体兴凯湖翘嘴鲌CAST表达量比较分析
• 4 讨论
• 4.1 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉物理特性比较
• 4.1.1 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体pH值和肉色比较
• 4.1.2 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉质构特性比较
• 4.2 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉常规营养分析比较
• 4.3 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体氨基酸含量与营养价值评价
• 4.3.1 氨基酸组成与含量比较
• 4.3.2 营养品质评价
• 4.4 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌肉脂肪酸组成比较
• 4.5 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体部分血液指标比较
• 4.6 兴凯湖翘嘴鲌野生与养殖群体肌纤维比较
• 4.7 兴凯湖翘嘴鲌相关肉质基因克隆和不同群体的表达比较分析
• 4.7.1 MYHs基因克隆与表达
• 4.7.2 MyoD基因克隆与表达
• 4.7.3 Leptin基因克隆与表达
• 4.7.4 CAST基因克隆与表达
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文