生物素—亲和素放大酶联免疫快速检测动物组织中莱克多巴胺残留

论文摘要

本论文以莱克多巴胺为试材,牛血清白蛋白（BSA）为载体,利用1,4-丁二醇二缩水甘油醚法（Linker法）合成莱克多巴胺免疫原（RAC-BSA）,用其免疫日本大耳白兔,获得与RAC结合力较高的抗血清,经Protein A-Sepharose 4B、BSA-Sepharose 4B免疫亲和层析柱二次纯化,制备出纯度较高的抗体。与此同时,论文研究了半抗原与载体蛋白结合的方法,利用三种方法合成并优选出RAC包被原。并在此基础上,分别建立了间接竞争生物素-亲和素放大酶联免疫方法（间接竞争BA-ELISA）和直接竞争生物素-亲和素放大酶联免疫方法（直接竞争BA-ELISA）,用于猪肉肌肉组织中RAC残留的快速检测。本研究主要获得以下结果:（1）合成莱克多巴胺免疫原,制备出高抗原结合力的莱克多巴胺抗血清。（2）制备了BSA-Sepharose 4B免疫亲和层析柱,进一步提纯抗血清。（3）分别利用琥珀酸酐法、琥珀酸酐-混合酸酐法及Linker法三种方法合成了RAC包被原。比较了三种包被原的偶联效果并最终优选出琥珀酸酐混合酸酐法偶联得到的包被原进行后续试验。（4）建立了间接BA-ELISA检测方法,用于猪肉肌肉组织中RAC残留的快速检测。所建立方法标准曲线的IC50及IC15分别为0.3±0.02 ng/mL与0.02±0.003 ng/mL,实际样品检出限为0.2μg/kg。板间及板内变异系数低于11%,样品平均加标回收率为77.1%。（5）建立了直接BA-ELISA检测方法,用于猪肉肌肉组织中RAC残留的快速检测。标准曲线的IC50及IC15分别为0.3±0.05 ng/mL与0.03±0.005 ng/mL,样品检出限为0.3μg/kg。板间及板内变异系数低于9%,样品的加标回收率在84%以上。（6）利用高效液相色谱法（HPLC）对建立的莱克多巴胺间接竞争、直接竞争生物素亲和素酶联免疫检测方法的准确性进行了进一步验证。检测结果均与HPLC方法有较高的相关性,线性相关系数R2值分别为0.9822和0.9915。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 莱克多巴胺残留的研究现状
• 1.1.1 RAC 结构及性质
• 1.1.2 RAC 代谢过程及残留危害
• 1.1.3 RAC 限量标准
• 1.1.4 莱克多巴胺残留检测方法综述
• 1.2 生物素亲和素放大酶免疫分析法
• 1.2.1 生物素亲和素放大酶免疫分析
• 1.2.2 生物素及活化物的性质
• 1.2.3 亲和素及链霉亲和素的性质
• 1.2.4 生物素-亲合素系统的优越性
• 1.3 选题的目的与研究内容
• 第二章 莱克多巴胺抗原的制备
• 2.1 试验材料与设备
• 2.1.1 试验试剂
• 2.1.2 试验设备
• 2.1.3 溶液配制
• 2.2 试验内容与方法
• 2.2.1 Linker 法合成免疫原
• 2.2.2 琥珀酸酐法合成包被原
• 2.2.3 琥珀酸酐-混合酸酐法合成包被原
• 2.2.4 Linker 法合成包被原
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RAC 免疫原的合成-Linker 法
• 2.3.2 琥珀酸酐法合成包被原
• 2.3.3 琥珀酸酐-混合酸酐法合成包被原
• 2.3.4 Linker 法合成包被原
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 莱克多巴胺多克隆抗体的制备及纯化
• 3.1 试验材料与设备
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 试验设备
• 3.1.4 溶液配制
• 3.2 试验内容与方法
• 3.2.1 免疫程序及采血
• 3.2.2 RAC 抗血清效价的测定
• 3.2.3 RAC 抗血清与半抗原结合力测定
• 3.2.4 莱克多巴胺多克隆抗体的纯化
• 3.2.5 抗体浓度测定
• 3.2.6 特异性测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 抗血清效价测定
• 3.3.2 抗血清与半抗原结合力测定
• 3.3.3 抗体的纯化结果及浓度测定
• 3.3.4 抗体特异性测定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 间接竞争BA-ELISA 检测方法的建立
• 4.1 试验材料与设备
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验试剂
• 4.1.3 试验仪器
• 4.1.4 溶液配制
• 4.2 试验内容与方法
• 4.2.1 间接竞争BA-ELISA 检测步骤
• 4.2.2 间接竞争BA-ELISA 检测条件优化
• 4.2.3 间接竞争BA-ELISA 标准曲线的建立
• 4.2.4 间接竞争BA-ELISA 分析的样品前处理方法
• 4.2.5 检测方法性能指标的评价
• 4.2.6 高效液相色谱检测方法确证
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 莱克多巴胺包被原的选择
• 4.3.2 间接竞争BA-ELISA 最佳工作条件的确定
• 4.3.3 间接竞争BA-ELISA 检测程序确立及标准曲线的绘制
• 4.3.4 检测方法性能指标评价
• 4.3.5 抗体纯化程度对间接BA-ELISA 反应体系的影响
• 4.3.6 基质影响的消除及添加回收试验
• 4.3.7 HPLC 确证
• 4.4 本章小结
• 第五章 直接竞争BA-ELISA 检测方法的建立
• 5.1 试验材料与设备
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验试剂
• 5.1.3 试验设备
• 5.1.4 溶液配制
• 5.2 试验内容与方法
• 5.2.1 生物素化抗体（B-Ab）的制备方法
• 5.2.2 直接竞争BA-ELISA 检测步骤
• 5.2.3 直接竞争BA-ELISA 方法标准曲线的建立
• 5.2.4 基质前处理方法
• 5.2.5 检测方法性能指标的评价
• 5.2.6 高效液相色谱检测方法确证
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 生物素抗体选择
• 5.3.2 直接RAC-BA-ELISA 检测条件确立及标准曲线的绘制
• 5.3.3 检测方法性能指标评价
• 5.3.4 基质影响的消除及添加回收试验
• 5.3.5 HPLC 确证
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论及创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩略词对照表
• 附录Ⅱ 莱克多巴胺类似物结构图
• 致谢
• 作者简介