番茄叶绿体谷胱甘肽还原酶基因的克隆和表达分析

论文摘要

逆境胁迫是目前农业生产上面临的严峻问题之一,逆境会导致植物体内产生大量的活性氧。活性氧可引起蛋白质、膜脂和其他细胞组分的损伤,进而导致细胞及组织死亡。谷胱甘肽还原酶作为植物活性氧清除系统中的一个关键酶,对于保护植物免受活性氧的破坏具有十分重要的作用。本研究从番茄叶片中分离到叶绿体谷胱甘肽还原酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到谷胱甘肽还原酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LeGR （EU285581）。该基因全长为1772 bp,ORF为765 bp,编码255个氨基酸,分子量约为33 kDa。同源序列比较表明,番茄谷胱甘肽还原酶基因的序列与烟草、拟南芥、水稻、豌豆、芸苔的谷胱甘肽还原酶基因的序列同源性较高。2. Northern杂交分析显示,LeGR在不同器官中呈非特异性表达,在叶片、茎、花萼等叶绿素含量高的组织中表达量较高。3. LeGR受低温和高温诱导,其表达量明显高于常温下,且其表达水平随逆境处理时间的延长而变化。4℃处理下6 h表达量最高,40℃处理下12 h表达量最高。4.将获得的LeGR与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄。5.构建了原核表达载体pET-LeGR,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示,表达蛋白符合预计分子量。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 1 引言
• 1.1 植物体内活性氧与其清除系统
• 1.2 低温胁迫对植物的影响
• 1.3 高温胁迫对植物的影响
• 1.4 本研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾
• 2.2.5 番茄叶绿体谷胱甘肽还原酶基因全长的克隆
• 2.2.6 Northern 杂交分析
• 2.2.7 真核表达载体的构建
• 2.2.8 谷胱甘肽还原酶的原核表达
• 2.2.9 番茄生理指标的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 LeGR 的分离
• 3.2 LeGR 的序列分析
• 3.3 LeGR 在番茄中的表达分析
• 3.3.1 LeGR 在番茄不同器官中的表达
• 3.3.2 不同温度下LeGR 在番茄中的表达
• 3.4 LeGR 在大肠杆菌中的表达
• 3.4.1 原核表达载体pET-LeGR 的构建
• 3.4.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.5 LeGR 在番茄中的遗传转化
• 3.5.1 正、反义表达载体的构建
• 3.5.2 转正、反义LeGR 植株的鉴定
• 2^-和H₂O₂ 含量的影响'>3.6 低温胁迫对野生型番茄O₂^-和H₂O₂含量的影响
• 4 讨论
• 4.1 LeGR 编码一种叶绿体谷胱甘肽还原酶
• 4.2 LeGR 在植物对低温、高温胁迫的应答中发挥重要作用
• 4.3 LeGR 在植物低温胁迫信号传导中的作用机制
• 4.4 谷胱甘肽代谢在植物对环境胁迫的应答中的地位
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文