重组嗜热醛酮还原酶的表达及性质研究

论文摘要

热稳定酮还原酶在有机合成中有着较大的应用潜力。本研究在基因组序列分析基础上,从超嗜热菌Thermotoga sp.和Thermotoga maritima中找到两条基因tadh1和tadh2。经过保守序列比较、同源建模等方式,基本确认这两条基因可编码醛酮还原酶。两条基因的开放阅读框分别长861bp和825bp,编码蛋白TADH1和TADH2理论相对分子质量分别为33.23kDa、31.49kDa。利用pET28a（+）分别成功构建了基因tadh1和tadh2的大肠杆菌表达系统。该系统诱导表达后的粗酶液可利用70℃、10min热纯化和和Ni+柱纯化进行简单有效的分离。酶学性质研究表明TADH1和TADH2均为NADPH依赖,具广谱底物特异性,对醛、酮酯（酸）和芳香族酮均具有较高活性。最佳温度均为90℃,最佳pH均为9.0。TADH2经85℃、15小时温浴后残留酶活63%,其热稳定性较TADH1高。Zn2+对两酶均有强烈抑制作用,K+对TADH1具有激活作用。EDTA和β-巯基乙醇无抑制作用,EDTA还使TADH1的酶活提高89%,表明酶属于非金属离子依赖型。SDS对酶活抑制作用明显。两种酶均具有良好的有机溶剂耐受性,10%（v/v）乙腈、甲醇、异丙醇、DMSO等有机溶剂存在下,酶活均无明显下降。以TADH1和TADH2为催化剂,进行含羰基化合物的不对称还原研究。选择了2,2,2-三氟苯乙酮、2-氧代-4苯基丁酸乙酯和4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,反应体系中加入葡萄糖脱氢酶和葡萄糖进行酶偶联的辅酶循环。两酶均可还原2,2,2-三氟苯乙酮,e.e.p都大于99%；还原2-氧代-4苯基丁酸乙酯生成S型醇产物,e.e.p分别为68.85%和69.93%；TADH1还原4-氯乙酰乙酸乙酯生成S型醇产物,e.e.p为86.76%,而TADH2催化此底物没有选择性。通过辅酶浓度、温度和反应体系pH等反应条件的优化,TADH2催化还原2,2,2-三氟苯乙酮的产率由9.5%上升至68%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 羰基类化合物的不对称还原
• 1.1.1 化学法不对称还原羰基
• 1.1.2 生物法不对称还原羰基
• 1.2 酮还原酶的研究现状
• 1.2.1 酮还原酶的分类
• 1.2.1.1 醛酮还原酶家族
• 1.2.1.2 短链脱氢酶/还原酶家族
• 1.2.1.3 中链脱氢酶/还原酶家族
• 1.2.2 酮还原酶的来源
• 1.2.2.1 产酶微生物的筛选和酶基因的克隆表达
• 1.2.2.2 Genome mining
• 1.2.2.3 宏基因组研究
• 1.2.3 酮还原酶的应用
• 1.3 全细胞催化和酶催化
• 1.4 辅酶循环系统
• 1.4.1 底物偶联法
• 1.4.2 酶偶联法
• 1.5 酮还原酶催化反应的进一步优化
• 1.5.1 酶改造
• 1.5.2 酶固定化
• 1.5.3 介质工程
• 1.5.4 底物修饰
• 1.6 本课题的立题依据和研究内容
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 重组嗜热醛酮还原酶的表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组表达质粒构建策略
• 2.2.2 PCR扩增目的基因
• 2.2.3 TA克隆
• 2.2.4 重组表达质粒的构建
• 2.2.5 醛酮还原酶的表达
• 2.2.6 表达产物SDS-PAGE分析
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 PCR扩增目的基因
• 2.3.3 TA克隆
• 2.3.4 重组表达载体pET28a-tadh1和pET28a-tadh2的鉴定
• 2.3.5 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.4 小结
• 第三章 醛酮还原酶酶学性质的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液与缓冲液
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组目的蛋白的纯化
• 3.2.2 还原酶活力的测定
• 3.2.2.1 原理
• 3.2.2.2 标准曲线的绘制
• 3.2.2.3 酶活力测定方法
• 3.2.3 酶学性质研究
• 3.2.3.1 底物特异性
• 3.2.3.2 辅酶依赖性
• 3.2.3.3 pH对酶活力的影响
• 3.2.3.4 温度对酶活力的影响及热稳定性
• 3.2.3.5 金属离子对酶活的影响
• 3.2.3.6 抑制剂和表面活性剂对酶活的影响
• 3.2.3.7 有机溶剂对酶活的影响
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 重组目的蛋白的纯化
• 3.3.2 NADPH标准曲线的绘制
• 3.3.3 酶学性质的研究
• 3.3.3.1 底物特异性
• 3.3.3.2 辅酶依赖性
• 3.3.3.3 pH对酶活力的影响
• 3.3.3.4 温度对酶活力的影响及热稳定性
• 3.3.3.5 金属离子对酶活的影响
• 3.3.3.6 抑制剂和表面活性剂对酶活的影响
• 3.3.3.7 有机溶剂对酶活的影响
• 3.4 小结
• 第四章 醛酮还原酶不对称还原生成手性醇的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 不对称还原反应
• 4.2.1.1 酶偶联再生辅酶反应系统
• 4.2.1.2 不对称还原2,2,2-三氟苯乙酮
• 4.2.1.3 不对称还原2-氧代-4苯基丁酸乙酯
• 4.2.1.4 不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯
• 4.2.2 还原过程中一些参量的计算
• 4.2.3 反应体系的优化
• 4.2.3.1 辅酶浓度
• 4.2.3.2 反应温度
• 4.2.3.3 反应体系pH
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 酶偶联再生辅酶反应体系
• 4.3.2 不对称还原2,2,2-三氟苯乙酮
• 4.3.2.1 标准品液相图
• 4.3.2.2 还原反应产物液相色谱图
• 4.3.3 不对称还原2-氧代-4苯基丁酸乙酯
• 4.3.3.1 标准品液相图
• 4.3.3.2 还原反应产物液相色谱图
• 4.3.4 不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯
• 4.3.4.1 标准品液相图
• 4.3.4.2 还原反应产物液相色谱图
• 4.3.5 反应体系的优化
• 4.3.5.1 辅酶浓度
• 4.3.5.2 反应温度
• 4.3.5.3 反应体系pH
• 4.4 小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录