HDAC6选择性小分子抑制剂发现及其神经保护作用机制研究

论文摘要

神经退行性疾病是一种老年性疾病,其最重要的病理学特征是神经细胞的进行性损伤与凋亡,病变机理包括线粒体功能障碍学说、氧化应激学说、蛋白质发生错误折叠聚集、炎症、免疫功能缺陷、基因突变等。近年研究表明蛋白乙酰化调控在神经细胞保护和促进内源性神经干细胞定向分化的过程中扮演重要的角色。其中组蛋白去乙酰化酶（HDAC） Ⅱb成员HDAC6的选择性抑制剂具有保护神经细胞生长以及促进轴突再生作用,表明HDAC6在神经损伤病理过程中起着重要的作用,是潜在药物靶点。但目前有效HDAC6选择性抑制剂很少,而且其作用机制尚不清楚。所以本文主要开展以下两方面的工作：一方面建立HDAC6选择性抑制剂筛选体系,发现新型HDAC6抑制剂并初步评价其神经保护作用；另一方面利用HDAC6阳性抑制剂探讨其对神经细胞生长保护的作用机制。首先建立HDAC6分子水平高通量筛选体系。利用昆虫表达系统表达纯化GST-HDAC6融合蛋白,采用底物Boc-lys-AMC建立体外HDAC6分子去乙酰化酶活测活方法。以SAHA为阳性抑制剂,对测活体系进行优化,确定适合高通量筛选的酶浓度,底物浓度及反应时间等,最终Z’因子达到0.60,符合高通量筛选要求,表明HDAC6分子水平高通量筛选体系建立成功。然后进行选择性HDAC6抑制剂的筛选。我们利用该模型以及实验室已有的HDAC1、HDAC3模型对药物所南发俊老师以及沈竞康老师的化合物进行筛选,发现结构新颖的HDAC6选择性的抑制剂LGP09295、LGP09286、LGP07073等,并对这些抑制剂在细胞水平上进行了评价,结果显示其在细胞水平同样具有HDACs选择性抑制活性。最后对新型HDAC6选择性抑制剂进行神经细胞生长保护的生物学功能评价。采用MTT方法评价筛选出的HDAC6选择性抑制剂以及阳性tubastatin A在氧化应激保护方面的作用,发现LGP07073、LGP07074均对由过氧化氢（H2O2）引起的大鼠神经元PC12和原代皮层神经元的氧化损伤具有保护作用。已知HDAC6抑制剂对神经细胞生长保护的机制是对抗氧化应激作用。但其机制目前仅有1篇文献报道,认为是通过直接抑制氧化调控相关蛋白peroxiredoxin （Prx）Ⅰ以及PrxⅡ的去乙酰化修饰,从而参与细胞内氧化应激的调控。本文利用HDAC6阳性抑制剂tubastatin A作为工具化合物进行作用机制研究,提出新的作用模式即通过直接阻止XBPls的去乙酰化,增加其蛋白稳定性,从而上调多个对抗氧化应激相关基因表达,进而对抗氧化应激。首先确认阳性抑制剂tubastatin A能够对抗H2O2诱导的PC12细胞株和大鼠原代神经元细胞的细胞生长抑制。通常当细胞内的过氧化水平提高时,会启动细胞内的抗氧化系统,超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（Catalase）、过氧化酶（Prx）等可以及时快速清除体内过剩的ROS。我们对Catalase、PRDX5、Pdia5、TRX等氧化应激相关基因进行转录水平的检测,发现在tubastatin A与H202同时存在的情况下,抗氧化应激的部分基因Catalase、PRDX5、Pdia5的转录水平明显增加,表明HDAC6抑制剂对抗氧化应激作用可能部分通过上调相关基因转录水平实现。然后我们对上述基因表达上调的作用机制进行探讨。通过文献信息分析,发现Catalase、PRDX5、Pdia5可以被转录因子X-box binding Protein1splicing form（XBP1s）调控。同时Q-PCR进一步证实XBPls负责调控的ERAD相关基因也显著上调,表明tubastatin A在H202处理的条件下,XBPls的转录活性上调。采用RNAi下调XBP1以及腺病毒过表达XBPls的方法在PC12细胞株上进行了相关验证。结果显示降低XBP1表达,可显著抑制Catalase、PRDX5、Pdia5基因转录水平的增加,同时可减弱tubastatin A对H202诱导的氧化损伤保护。腺病毒过表达XBPls不仅可以上调Catalase、PRDX5、Pdia5的表达,而且可以直接对抗H2O2带来的细胞生长抑制。以上结果表明HDAC6抑制剂至少是部分通过促进XBPls的转录活性,上调相关抗氧化应激基因表达。接着对HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A促进XBP1s转录活性的作用机制进行研究。首先发现HDAC6抑制剂会促进XBP1s蛋白表达,但并不直接影响XBP1mRNA转录与剪切。另外通过过表达野生型以及无去乙酰化活性的HDAC6,确证XBP1s蛋白水平增加依赖于HDAC6去乙酰化活性。而且抑制除HDACⅡb以外的其他HDAC抑制剂--VPA对XBP1s蛋白表达没有影响。在HEK293T细胞共同过表达HDAC6与XBP1s,通过Co-IP实验证实HDAC6与XBP1s直接相互作用,HDAC6的相互作用区段在其HUB区域。Western检测显示Tubastatin A抑制剂处理后,XBP1s蛋白乙酰化水平明显上升,提示抑制剂可能通过抑制HDAC6去乙酰化活性,增强XBP1s的乙酰化程度。然后通过生物信息学预测与蛋白质谱鉴定相结合,首次确定XBPls的乙酰化位点包括K241、K257、K276、K297等。最后我们对XBPls蛋白水平增加是否与其蛋白降解减缓相关进行了考察。有研究表明XBPls的降解途径是通过蛋白酶体途径,通过cycloheximide （CHX）阻止蛋白合成以及MG132抑制蛋白的降解,表明tubastatin A的确是通过减缓XBPls的降解,最终导致其蛋白水平增加。最后结合序列保守性以及蛋白质谱乙酰化鉴定位点对K241等四个位点进行了点突变,并考察相关位点对蛋白降解以及蛋白转录活性调控的影响。综上所述,我们建立了HDAC6选择性小分子抑制剂的高通量筛选体系,成功筛选出一些结构新颖、具有神经保护作用的小分子抑制剂,为神经保护新药研发提供了新的物质基础。运用HDAC6阳性抑制剂进行神经保护的功能及机制研究,首次发现转录因子XBP1s参与tubastatin A逆转H2O2诱导的神经细胞氧化损伤调控。其机制是tubastatin A通过抑制HDAC6的去乙酰化活性,减缓转录因子XBP1s蛋白降解,增加其蛋白水平以及转录活性促进XBPls调控的抗氧化蛋白表达。该工作为进一步HDAC6选择性小分子发现及其应用于神经保护提供了新的理论基础,为神经退行性疾病治疗提供新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）选择性抑制剂发现与生物活性评价
• 前言
• 第一节 HDAC6抑制剂分子水平高通量筛选模型的建立与抑制剂筛选
• 第二节 HDAC6选择性小分子抑制剂细胞水平选择性评价
• 第三节 HDAC6抑制剂细胞水平神经保护功能评价
• 本章小结
• 第二章 XBP1s参与HDAC6抑制剂氧化应激保护的机制研究
• 前言
• 第一节 XBP1s在tubastatin A逆转神经细胞氧化损伤中起重要作用
• 第一小节 tubastatin A促进氧化应激保护相关基因表达
• 第二小节 XBP1S在氧化应激保护中具有重要作用
• 第二节 HDAC6对XBP1s的调控机制研究
• 第一小节 HDAC6抑制剂增加XBP1s蛋白水平并依赖其去乙酰化酶活性
• 第二小节 HDAC6与XBP1s相互作用并去乙酰化XBP1s
• 第三小节 HDAC6抑制剂通过抑制XBP1s的降解增加其蛋白水平
• 本章小结
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢