论文摘要
课题背景溃疡性结肠炎（UICerativeColitiS, UC）是一种由感染因素、自身免疫因素、遗传因素和环境等因素导致的慢性疾病,以直肠和结肠粘膜下层的非特异性炎症病变为主要症状,主要累及直肠和乙状结肠,也可侵及其它部分或全部结肠和末端回肠。临床表现以腹痛、腹泻、脓血便或里急后重及消化不良为主。西医用于治疗溃疡性结肠炎的药物主要是氨基水杨酸类、肾上腺皮质激素类、抗菌药物、免疫抑制药等。这些药物可控制患者的临床症状,但不良反应多而严重。中药在治疗溃疡性结肠炎方面具有很大的优势,改善临床症状明显,疗效确切,副作用小,价格低廉。香连丸是中国药典一部收载的中成药,由黄连（吴茱萸制）800g、木香200g醋糊为丸,具有清热化湿,行气止痛之功效,主要用于大肠湿热所致的痢疾,症见大便脓血,里急后重,发热腹痛；肠炎、细菌性痢疾,临床上多用于治疗溃疡性结肠炎。本课题针对传统中药复方存在的不足,拟对香连丸进行二次开发,按照中药六类2新药的技术要求,进行药学研究和药理学研究。课题组前期已完成了对萸黄连生物碱和木香挥发油的提取工艺,并对它们进行了药效学评价,确定了黄连生物碱和木香挥发油是香连丸治疗溃疡性结肠炎的活性部位。本文根据中药六类2新药的技术要求,对前期工作存在的不足进行了改进,并在其基础上进行了更深入的研究。其主要的研究目的、方法、结果和结论具体如下。研究目的1、在课题组前期研究的基础上对萸黄连的有效部位进行提取精制,建立更完善的质量标准。2、对木香挥发油的成分进行分析,明确木香挥发油的主要成分。3、对萸黄连生物碱有效部位和木香挥发油有效部位进行配比的药效学研究,选出萸黄连生物碱和木香挥发油的最佳配伍比例。4、研究香连丸的有效部位组方对小鼠急性溃疡性结肠炎的治疗作用。实验方法1、萸黄连生物碱有效部位的提取：取萸黄连饮片,以80%的乙醇为溶剂,提取两次,合并提取液,减压回收乙醇,得浓缩液,浓缩液加浓盐酸调pH后加NaCl盐析,过滤,沉淀物80℃干燥得萸黄连生物碱有效部位Ⅰ,上清液经HPD100大孔树脂处理得萸黄连生物碱有效部位Ⅱ,合并萸黄连生物碱有效部位Ⅰ和萸黄连生物碱有效部位Ⅱ得萸黄连生物碱总有效部位。本课题主要考察了大孔吸附树脂精制工艺中洗脱条件对总生物碱的影响,以总生物碱的含量和收率,盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱的含量作为考察指标,优化大孔吸附树脂洗脱工艺。萸黄连生物碱有效部位中黄连和吴茱萸成分的鉴别采用薄层色谱（TLC）法,黄连总生物碱含量测定方法采用紫外分光光度（UV）法。盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱的含量采用高效液相色谱（HPLC）法测定。2、气质联用（GC-MS）方法鉴定木香挥发油中的成分：采用GC-MS鉴定水蒸气蒸馏与超临界CO2萃取木香挥发油中的成分。3、香连丸有效部位配伍配比的药效学研究：采用均匀设计的方法,分为5个剂量配比组,以镇痛、止泻两个实验结果为指标,综合统计结果,选出最佳配伍比例。镇痛实验采用醋酸致小鼠扭体法,以扭体次数为观察指标；止泻实验采用番泻叶致小鼠腹泻的方法,以腹泻指数为指标,最后以这两个指标的加权综合结果来评价香连丸有效部位的最佳配比。4、香连丸有效部位组方对小鼠急性溃疡性结肠炎的药效学实验：以葡聚糖硫酸钠（DSS）和20%乙醇联合诱导小鼠急性期UC模型,分组灌胃给予香连丸有效部位（0.292g/kg、0.584g/kg、1.168g/kg）,萸黄连生物碱（0.7g/kg）,木香挥发油包合物（1.097g/kg）,观察各组小鼠的一般状态、疾病活动指数、结肠性状、结肠组织病理学变化,进行疾病活动指数评分（disease activity index, DAI）、测定各鼠结肠长度重量比、脾脏系数、血清中MDA的含量。实验结果1、萸黄连生物碱有效部位精制工艺中大孔吸附树脂的最佳洗脱条件为先用7.5BV的蒸馏水水洗,弃蒸馏水洗液,再用7.5BV的95%乙醇溶液洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇,80℃干燥。萸黄连生物碱有效部位Ⅰ的得率为7.68%,其中黄连总生物碱的转移率为59.7%,黄连总生物碱含量为87.64%,其中盐酸药根碱占3.90%,盐酸黄连碱占17.95%,盐酸小檗碱占57.58%,盐酸巴马汀占5.13%：萸黄连生物碱有效部位Ⅱ的得率为5.38%,其中黄连总生物碱的转移率为29.47%,黄连总生物碱含量为61.68%,其中盐酸药根碱占7.46%,盐酸黄连碱占7.19%,盐酸小檗碱占13.63%,盐酸巴马汀占10.08%。TLC法鉴定萸黄连生物碱有效部位中黄连和吴茱萸成分的鉴别条件为：采用高效硅胶铝板,以石油醚一氯仿一二乙胺（5：2：0.2）为展开剂,0.02%的香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂,置紫外光灯（365nm）下检视。可检测出萸黄连生物碱有效部位中的吴茱萸和黄连成分。UV法测定总生物碱含量的线性范围为4.17μg/ml～20.85μg/ml,r2=0.9995（n=5）；平均回收率为99.43%,RSD为4.05%；HPLC法测定各生物碱的的条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB—C18;流动相：乙腈：水（57：43）,其中水中加入0.015m1/L的十二烷基硫酸钠,磷酸调pH至1.5；柱温：30℃；流速：1ml/min;检测波长：345nm。2、GC-MS鉴定水蒸气蒸馏（SD）与超临界CO2萃取（SFE）木香挥发油中的成分。SD提取物分离出77个峰,SFE提取物分离出44个峰。每个组分的质谱图由计算机检索与文献对照,SD提取物鉴定了其中52种组分,占总面积的95.40%,SFE提取物鉴定了其中36种组分,占总面积的97.03%,两者的成分及相对含量都有较大差别,共有成分为39个。3、香连丸有效部位配伍配比的药效学研究表明：香连丸有效部位组方对醋酸致小鼠疼痛的扭体次数有减少作用,与模型组比较,配比组2、3、5的扭体次数存在显著性差异（P<0.01）,配比组1、4组不存在显著性差异；香连丸有效部位组方对番泻叶致小鼠腹泻具有治疗作用,与模型组比较,配比组1的腹泻指数无显著性差异（P=0.995）,其他配比组均存在显著性差异（P=0.000）；当扭体次数与腹泻指数的权衡系数为0.5：0.5时,黄连生物碱（X1）、木香挥发油包合物（X2）与镇痛和止泻的综合指标（Y）的拟合方程为：Y=1.25-27818.2X12-170017X22+121902.4X1X2（P=0.014,F=2627.106,R=1.000）4、香连丸有效部位及组方对小鼠急性溃疡性结肠炎的药效学实验：正常组小鼠大便正常,毛色光泽,活动自如,体重增加。模型组小鼠在灌胃给予8%DSS2d后出现软便稀便,20%乙醇灌肠后出现严重腹泻,一周后体重减轻、毛无光泽、活动减少。各给药组小鼠毛色、精神及活动度较模型组健康,其腹泻、便血症状及DAI有不同程度的减轻。DAI评分显示模型组小鼠DAI显著高于正常组,差异具有统计学意义（P<0.01）,各治疗组DAI均低于模型组,其中香连丸有效部位中剂量组和高剂量组差异具有统计学意义（P<0.05）,但各治疗组间无显著性差异。结肠外观症状显示正常组小鼠结肠外观正常,未见充血水肿,粪便成型,模型组小鼠全结肠充血、水肿、肠壁增厚,严重者肠腔内有大量血性分泌物,比正常组小鼠的结肠明显缩短,各给药组结肠有轻度水肿,结肠较正常组略有缩短。结肠长度重量比显示模型组显著高于正常组,且差异具有统计学意义（P=0.000）,各给药组结肠长度重量比显著低于模型组（P=0.000）,各组间无统计学差异。结肠切片光镜下观察显示,正常对照组小鼠结肠黏膜完整连续、腺体排列整齐规则、结构清楚、无炎细胞浸润和溃疡形成,模型组小鼠结肠黏膜呈明显的急性肠炎反应,表现为部分黏膜细胞破损、腺体正常结构丧失、排列紊乱、水肿；黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润。木香挥发油包合物组和有效部位低剂量组的结肠粘膜水肿明显,腺体正常结构破坏严重,排列紊乱,有大量的炎性细胞浸润。其他给药组小鼠症状明显改善,结肠黏膜完整,无明显充血水肿,局部有少量炎性细胞浸润,肠腺排列基本规则,结构比较清楚。小鼠血清中MDA含量与正常组相比,模型组小鼠明显升高,具有统计学意义（P=0.000）,给药后,各给药组小鼠血清中MDA含量均有下降,与模型组相比均具有显著性差异（P<0.05）,但各治疗组间无显著性差异（P>0.05）研究结论1、采用80%乙醇提取,盐析和大孔树脂结合精制的方法得到的萸黄连生物碱有效部位,提取率高,质量可控；得到的提取物中总生物碱的含量达50%以上,符合有效部位提取物的要求。采用TLC法鉴别提取物中的吴茱萸与黄连,方法简便、可行、快捷；用紫外分光光度法和高效液相法测定提取物中总生物碱的含量和各生物碱含量,方法准确、可靠、简便,可作为萸黄连生物碱有效部位的质量控制方法。2、初步完成了木香挥发油的成分鉴别。3、香连丸有效部位组方能减少醋酸致小鼠扭体的次数和番泻叶致小鼠腹泻的腹泻指数。扭体次数与腹泻指数的权衡比例为0.5：0.5时,香连丸有效部位的最佳配比是萸黄连生物碱：木香挥发油包合物=36：2.7。4、香连丸对DSS和乙醇联合诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎有较好的治疗作用,且疗效优于柳氮磺胺吡啶。
论文目录
相关论文文献
- [1].药对萸黄连-木香挥发性成分的GC-MS分析[J]. 广东化工 2016(22)
- [2].基于LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析萸黄连中的成分[J]. 中药材 2018(05)
- [3].萸黄连饮片“反制”前后物质基础差异性研究[J]. 药物分析杂志 2011(01)
- [4].HPLC-ESI-MS同时分析萸黄连饮片及其制剂中的活性成分[J]. 中草药 2012(02)
- [5].萸黄连的炮制辅料——吴茱萸汁的提取工艺优选研究[J]. 中国中医药信息杂志 2010(06)
- [6].高效液相色谱法同时测定萸黄连饮片中2组分含量[J]. 中国药业 2015(22)
- [7].炮制对含生物碱类中药的影响分析[J]. 云南中医中药杂志 2016(10)
- [8].正交试验法优选吴茱萸水提工艺[J]. 现代中药研究与实践 2015(02)
- [9].不同用量的吴茱萸炮制过的黄连的成分变化[J]. 中国中医药现代远程教育 2013(16)
- [10].多指标正交试验优选萸黄连最佳提取工艺[J]. 中药材 2009(02)
- [11].萸黄连炮制工艺优选[J]. 中药材 2010(04)
- [12].萸黄连指纹图谱的研究[J]. 中华中医药杂志 2014(12)
- [13].基于动物行为学考察萸黄连“反制”前后的药性差异研究[J]. 中华中医药杂志 2011(12)
- [14].正交设计优选微波法炮制萸黄连的最佳工艺[J]. 中国中医药信息杂志 2010(03)
- [15].萸黄连炮制研究进展及炮制机制研究思路与方法[J]. 中国中药杂志 2009(10)
- [16].HPLC-DAD法测定炮制辅料吴茱萸汁中绿原酸、吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱[J]. 中草药 2010(03)
- [17].基于高效液相色谱指纹图谱及红外光谱评价黄连及其炮制品质量差异[J]. 中南药学 2019(04)
- [18].萸黄连总生物碱醇提取工艺研究[J]. 医药导报 2009(07)