论文摘要
第一章大鼠肝移植模型的建立及排斥品系的选择目的:建立大鼠原位肝移植动物模型,总结手术技巧和方法,观察封闭群SD→Wistar,近交系Lewis→BN大鼠同种异体急性排斥反应的发生发展以及基本病理生理指标变化过程。方法:将大鼠分为两组,一组为封闭群SD→Wistar,另一组为近交系Lewis→BN,每组30对,通过改良的双袖套法行原位肝移植,即肝上下腔静脉用缝合法连续吻合,门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合,胆管内支架法完成胆道重建。观察大鼠手术成功率,并发症和术后生存率。术后第3,5,7天各杀3只大鼠取肝组织观察病理变化,全自动生化分析法测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）水平变化,并观察两组大鼠术后存活时间。结果:两组大鼠原位肝移植术主要手术步骤所需时间无明显差异（P＞0.05）。封闭群组48h存活率为93.3%,近交系组48h存活率为90.0%,两组差异无统计学意义（P＞0.05）。术中死亡的主要原因:麻醉过深,呼吸道堵塞,失血性休克。术后48h内死亡的主要原因是血管吻合口漏血,血栓形成。术后生存超过48h死亡的主要原因是感染,胆道梗阻。封闭群大鼠1个月存活率为83.3%,近交系大鼠术后11天内全部死亡,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。封闭群大鼠术后第3天排斥反应平均分级为Williams2级,第5天排斥反应平均分级为Williams1级,第7天排斥反应平均分级为Williams1级。近交系大鼠术后第3天排斥反应平均分级为Williams2级,第5天排斥反应平均分级为Williams2级,第7天排斥反应平均分级为Williams3级。封闭群大鼠血清ALT、AST及TBIL随移植术后时间延长而降低,移植肝组织病理改变随移植术后时间延长呈好转表现。近交系大鼠血清ALT、AST及TBIL随移植术后时间延长而升高,移植肝组织病理改变随移植术后时间延长而恶化。结论:熟练的显微外科技术是模型成功的关键。我们对Kamada“双袖套法”做了如下改良:1)逆时针游离供肝。2)供肝完全游离后经腹主动脉进行肝脏灌洗。3)修整肝上腔静脉时不保留膈肌环。获得了良好的效果。SD→Wistar组合出现自然耐受,理论和实际上均不适用于肝移植排斥反应的研究。Lewis→BN组合的临床及组织学特征均符合肝移植急排标准,是一组稳定的急排模型,近交系大鼠对手术耐受性尚可,建模难度和封闭群相差不大,可用于肝脏移植免疫的基础研究。第二章热休克预处理供肝对肝移植大鼠细胞因子及γδT细胞的影响目的:探讨热休克预处理供肝对肝移植大鼠术后急性排斥反应的抑制作用以及对细胞因子,γδT细胞的影响。方法:纯系雄性Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,随机分为2组进行实验:对照组:供体麻醉后24h取肝行Lewis→BN原位肝移植。热休克预处理组:供体麻醉后置于恒温水浴箱内,使其肛温保持43℃15分钟,24h后取肝行Lewis→BN原位肝移植。存活＞2 d,视为手术成功,＜2d被认为手术失败,而非急性排斥相关的死亡。分别于术后3d,5d,7d,12d每个时点杀死3只大鼠收集肝脏组织观察病理学改变,全自动生化分析仪测定肝功,ELISA行血清细胞因子IL-2、IFN-γ,IL-10,IL-4测定,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝脏组织细胞因子mRNA表达,肝组织提取单个核细胞流式检测γδT。观察剩余大鼠术后存活时间。结果:两组大鼠排斥反应程度随时间推移而逐步加重,热休克预处理组轻于同期对照组。两组大鼠ALT、AST、TBIL随时间推移而逐步升高,热休克预处理组低于同期对照组（P＜0.05）。两组大鼠肝脏浸润炎症细胞随时间推移而逐步加重,热休克预处理组低于同期对照组（P＜0.05）。ELISA血清细胞因子检查两组大鼠IL-2、IFN-γ随时间推移而逐步升高,热休克预处理组低于同期对照组（P＜0.05）。两组IL-10术后亦有升高,但两组间无差别（P＞0.05）,IL-4术后两组均不能测出。RT-PCR检查两组大鼠IL-2、IFN-γmRNA相对表达量随时间推移而逐步升高,热休克预处理组低于同期对照组（P＜0.05）。两组IL-10,IL-4mRNA相对表达量无明显改变,两组差异无统计学意义（P＞0.05）。热休克预处理组肝组织提取单个核细胞中γδT高于同期对照组,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组大鼠中位生存期为9天,热休克预处理组中位生存期为15天,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:热休克预处理可提高移植肝脏单个核细胞中γδT的比率;延缓Th1细胞因子上升趋势,但对Th2细胞因子无明显作用,从而影响了Th1/Th2细胞因子平衡;术后γδT比率和细胞因子分泌无相关性;热休克预处理供肝可减少肝脏浸润炎症细胞;热休克预处理可延长大鼠肝移植的存活时间。第三章热休克蛋白60延长小鼠移植皮肤存活时间的实验研究目的:探讨热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）对小鼠移植皮片成活的影响及其机制。方法:选用C57BL/6（H-2b）小鼠为受体、BALB/C（H-2d）小鼠、CBA/N（H-2k）小鼠为供体,小鼠均为8～12周龄近交系雌性。受体C57BL/6小鼠随机分为4组,每组15只。A组:无菌取BALB/C小鼠背部1cm×1cm全层皮片,刮去皮下组织后移植至受体小鼠背部。B组:C57BL/6小鼠背部皮下注射0.1 mL不完全弗氏佐剂（ImcompletedFreund’s adjuvant,IFA）,2周后行BALB/C小鼠皮肤移植。C组:C57BL/6小鼠背部皮下注射经IFA0.1 mL乳化后的50μg HSP60,2周后行BALB/C小鼠皮肤移植。D组:C57BL/6小鼠背部皮下注射经IFA0.1 mL乳化后的50μg HSP60,2周后行CBA/N小鼠皮肤移植。术后观察移植皮片成活时间;移植后7、25 d行单向混合淋巴细胞反应及混合淋巴细胞培养上清液细胞因子检测;皮肤移植后7 d进行迟发型超敏反应测定。结果:A、B、C、D组移植皮肤成活时间为12.4±0.5d、11.6±0.8d、28.3±2.6d及26.4±2.1d,A、B组与C、D组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,A、B组间及C、D组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤移植后7 d,A、B、C、D组混合淋巴细胞反应cpm值分别为12836±1357,11876±1265,6581±573,6843±612。A、B组与C、D组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;A、B组间及C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤移植后25 d,A、B、C、D组混合淋巴细胞反应cpm值分别为13286±1498,12960±1376,11936±1265,12374±1269。各组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤移植后7 d,C、D组混合淋巴细胞培养上清液IL-10高于A、B组,IL-2、IFN-γ低于A、B组,差异有统计学意义（P＜0.05）,A、B组间及C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤移植后25 d,各组IL-2、IL-10及IFN-γ差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤移植后7 d,A、B、C、D组受体小鼠对供体小鼠脾细胞的迟发型超敏反应为0.84±0.09 mm、0.81±0.07 mm、0.43±0.05 mm、0.46±0.03 mm,A、B组与C、D组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;A、B组间及C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:HSP60可通过调节Th1/Th2细胞因子延长小鼠移植皮片存活时间。
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