耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究

论文摘要

乳糖酶（β-D-半乳糖苷酶,β-D-galactoside-galactohydrolase, EC 3.2.1.23）为一种水解酶,可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,目前广泛应用于医药、食品、环保等领域。冷适应乳糖酶具有在低温下高活性的优点,应用在乳品加工和乳清引起的环境污染治理等方面,有着中温和高温乳糖酶无法达到的优越性。同时南极地区被认为是一个潜在的、重要的微生物资源库,可能是产生新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地。我们实验室从采集自南极的海泥样品中筛选到33株酵母菌,本实验在15℃条件下,采用X-gal定性试验和ONPG定量试验从这33株酵母中筛选产乳糖酶的菌株,结果筛选到1株高产乳糖酶菌株17-1,经酵母菌常规方法和分子生物学方法鉴定,我们将其鉴定为一株普鲁兰久浩酵母（Guehomyces pullulans）。研究发现,G. pullulans 17-1菌株可同时产胞外和与细胞结合的（Cell-bound）乳糖酶,根据温度对菌体生长的影响,我们判定菌株17-1为一株耐冷型酵母。对耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株产乳糖酶的培养基及培养条件进行了优化,确定了最佳培养基成分为（w/v）：乳糖3.0%,酵母粉0.7%,蛋白胨0.3%,紫苏油0.02%, KH2PO4 0.28%, MgSO4·7HO20.06%, MnSO4·3HO2 0.00085%,培养基初始pH为4.5,蒸馏水配制；最佳培养条件为：15℃、170 rpm振荡培养132 h,此时耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株乳糖酶总产量可达13.9 U/mL。对发酵罐高密度发酵产酶条件进行了初探,实验结果表明可以将该乳糖酶的总产量提高到25.3U/mL。用粗酶样品水解乳糖溶液,水解产物为葡萄糖和半乳糖,水解牛奶可产生大量还原糖。G. pullulans 17-1菌株胞外乳糖酶经超滤法浓缩、SephadexTM G-200凝胶过滤、CM-Sepharose F.F.阳离子交换层析得到了纯化,比活力提高2.4倍。SDS-PAGE显示其单亚基分子量约为170.0 kDa,用凝胶过滤层析法测得该纯化酶的分子量约为335.0 kDa,因此推测G. pullulans 17-1菌株乳糖酶是一个同源二聚体。对该纯化酶的酶学性质进行了研究,结果表明：其最适作用温度和pH分别为50℃和4.0,受Ag+、Hg2+的强烈抑制（8.2%,8.4%）,Li+离子对它有一定激活作用,对底物ONPG的Km值和Vmax分别为3.3 mM和9.2μmol/min。一级蛋白质谱分析表明,该乳糖酶的一个肽片ALEEYKK与其它已知酵母乳糖酶序列相匹配。将纯化的乳糖酶和4.6%乳糖溶液混合,50℃下孵育4 h后,测得乳糖溶液的水解率为43.5%,实验结果表明该乳糖酶在食品工业中有潜在的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 南极低温微生物的研究现状
• 1.1.1 适冷机制的研究
• 1.1.2 产冷适应性酶的研究
• 1.2 乳糖酶简介
• 1.2.1 结构及催化机理
• 1.2.2 活力测定方法
• 1.3 乳糖酶的国内外研究现状及进展
• 1.3.1 微生物来源
• 1.3.2 发酵生产
• 1.3.3 分离纯化及性质研究
• 1.3.4 分子生物学研究
• 1.4 微生物乳糖酶的应用
• 1.4.1 满足乳糖不耐症患者的需要
• 1.4.2 在浓缩乳制品及发酵乳制品中的应用
• 1.4.3 乳清糖浆和半乳果葡糖浆的制造及应用
• 1.4.4 在制药工业中的应用
• 1.4.5 生产低聚半乳糖
• 1.5 本论文的研究目的与意义
• 第二章 产乳糖酶南极酵母菌株的筛选和鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 D1/D2 26S rDNA的PCR扩增引物（Sugita et al.,2003）
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 乳糖酶活力的测定
• 2.3.2 产乳糖酶菌株的初筛
• 2.3.3 种子液的制备
• 2.3.4 产乳糖酶菌株的复筛
• 2.3.5 酵母菌的常规方法鉴定
• 2.3.6 分子生物学方法鉴定
• 2.3.7 细胞生长量的测定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 初筛结果
• 2.4.2 复筛结果
• 2.4.3 常规方法鉴定结果
• 2.4.4 分子生物学鉴定结果
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 耐冷酵母G.pullulans 17-1菌株乳糖酶的生产条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 胞外酶活力测定方法
• 3.2.5 菌体生长量的测定
• 3.2.6 发酵培养基优化
• 3.2.7 薄层层析分析（TLC）
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 温度对产胞外乳糖酶及菌体生长的影响
• 3.3.2 碳源优化结果
• 3.3.3 氮源优化结果
• 3.3.4 培养基初始pH的选择
• 3.3.5 不同无机盐对产胞外酶及菌体生长的影响
• 3.3.6 添加紫苏油对产酶的影响
• 3.3.7 最适培养条件下的产酶及菌体生长曲线
• 3.3.8 发酵罐高密度发酵产酶条件初探
• 3.3.9 粗酶水解结果
• 3.4 本章小结
• 第四章 耐冷酵母G.pullulans 17-1菌株胞外乳糖酶的分离纯化及性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 粗酶液的制备
• 4.2.4 乳糖酶活力测定
• 4.2.5 总蛋白含量的测定
• 4.2.6 胞外乳糖酶的分离纯化
• 4.2.7 纯化乳糖酶的酶学性质研究
• 4.3 结果与讨论
• TMG-200凝胶过滤'>4.3.1 Sephadex^TMG-200凝胶过滤
• 4.3.2 CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析纯化
• 4.3.3 酶纯化过程参数和不连续SDS-PAGE电泳
• 4.3.4 凝胶层析法测分子量结果
• 4.3.5 最适作用温度及温度稳定性
• 4.3.6 最适作用pH及其稳定性
• 4.3.7 金属离子对纯化酶的影响
• 4.3.8 蛋白抑制剂的影响
• 4.3.9 纯化酶的动力学参数
• 4.3.10 纯化酶一级蛋白质谱分析结果
• 4.3.11 纯化酶的水解结果
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 附录
• 致谢
• 个人简历及发表的学术论文