中药苏木和新合成的化学药对血源性细胞的诱导作用研究

论文摘要

由于工业化生产造成的环境污染、人类生活习惯等因素,各种肿瘤发生率逐年增加。为了寻找低毒、高效的抗癌药,本文研究了中药苏木和化学合成新药对来源于脐带血的正常干、祖细胞和血源性的癌细胞的正负调节作用,进一步探讨其作用于靶细胞的可能机理,并筛选各种生物活性成分的有效浓度如IC50,为临床治疗各种肿瘤及辅助性治疗方法提供可靠的实验依据。应用现代细胞培养技术、分子生物学技术、纳米技术及免疫标记技术,通过激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜、扫描电镜、荧光显微镜、光学显微镜和PCR仪等仪器,研究传统活血化瘀的中药苏木水提物为对来源于脐带血的造血干细胞向粒系、淋巴系方向分化的正向调节作用和对髓系白血病细胞系（K562细胞）的负向调节作用;使用近年出现的新剂型—脂质体包裹苏木水提物,探讨细胞内给药的新方法;同时还通过MTT法对200多种化学合成新药进行活性筛选,研究它们对K562细胞的负调节作用。研究结果:1.苏木水提物可以明显抑制K562细胞的增殖,各实验组与空白对照组相比均有差异（P＜0.05）,且抑制率与浓度成显著的相关性(r24h=0.90001004、r48h=0.984114411和r72h=0.973074678);在48h、100μg/ml时的作用效果最为明显;25μg/ml时,对细胞增殖的抑制作用与5-Fu（50μg/ml）相当;苏木脂质体能明显抑制K562细胞的集落形成（与对照组相比P＜0.05）,集落形成数与药物浓度呈现负相关（r=0.978）;IC50为129.92μg/ml;2.苏木脂质体具有诱导K562细胞凋亡的作用:荧光显微镜（荧光染色）、普通光学显微镜（瑞氏染色）、共聚焦成像、透射电镜观察细胞形态,均发现细胞核固缩、核碎裂、膜起泡、凋亡小体等各种典型的细胞凋亡形态的形成,且瑞氏染色和荧光染色的实验结果与对照组比较差别有统计学意义（P＜0.05）,抑制率与浓度之间呈现依赖关系（r=0.9～1）;DNA琼脂糖凝胶电泳图可见典型的DNA ladder电泳条带;流式细胞仪检测出实验组有高于对照组5倍的凋亡峰（18.6%:3.1%）;3.RT-PCR实验证明苏木脂质体诱导凋亡基因p53、Caspase-3、Rb,细胞周期的调控基因p16,以及具有双向调节作用的特殊基因Bcl-2基因的表达;4.原子力显微镜、扫描电子显微镜检测自制的磁性荧光纳米材料（IFN）平均粒径为122nm;体外毒性实验表现为对K562、Hela细胞和小鼠原代骨髓细胞的增殖没有明显的抑制作用（p＞0.05）;5.苏木水提物可诱导脐血造血干细胞向粒—单祖细胞（CD33）方向分化:靶细胞在体外培养的7d时,最佳浓度为25μg/ml;靶细胞在体外培养的2.5d、3.5d时,最佳浓度为50μg/ml;在2.5d、3.5d时,细胞阳性率与药物浓度呈正相关（r=0.9663、0.715526）;6.苏木水提物可诱导脐血单个核细胞向B系方向分化:靶细胞在体外培养2.5d、3.5d后,各实验组与对照组相比有差异（p＜0.05）,阳性率均高于70%;在培养时间延长到7d,CD19+细胞数量趋于平缓;50μg/ml处,达到峰值,接近30%;7.苏木水提物可诱导脐血单个核细胞向淋巴系方向分化:靶细胞在体外培养培养后,在37.5μg/ml的诱导下,2.5d、3.5d时分别到最高点,约88%和92%;CD4的阳性率与药物浓度之间成显著正相关(r2.5d=0.9818665,r3.5d=0.8355519);8.苏木水提物可诱导造血干细胞（CD117+细胞）向T淋巴细胞（CD4）分化。其峰值为37.5μg/ml,且CD4阳性率随苏木浓度的增加而升高（r=0.910386）;9.MTT法对200多种新合成的化学药进行抗癌活性筛选,发现其中54多种化合物对K562细胞有明显地抑制作用,各实验组与对照组相比有差异（p＜0.05）,药物浓度与抑制率之间成正相关（0.9＜r＜1）;10.为BPA-4的化合物可诱导靶细胞出现核碎裂、凋亡小体、核固缩等凋亡特征,琼脂糖凝胶电泳出现明显的DNA ladder,流式细胞仪检测出超过对照5倍的凋亡细胞的亚二倍体（18.6%:3.1%）,同时流式细胞仪对细胞周期分析表明K562细胞停留在G0-G1期。由以上结果得出下列结论:1.苏木水提物对来源于髓系白血病细胞系K562具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机理可能通过影响相关基因（p53基因、bcl-2基因、p16基因、Caspase基因和Rb基因）的表达而实现其抗癌活性。2.苏木水提物具有诱导脐血单个核细胞向粒—单祖细胞和成熟免疫细胞分化的正向调节作用,表现为靶细胞表面膜的分化抗原出现粒系祖细胞（CD33）、B淋巴细胞（CD19）和T淋巴细胞（CD4）特有的表面标志。3.在筛选的200多种抗癌化合物中,有54种对K562有明显的增殖抑制作用,其中的BPA-4可诱导K562细胞凋亡、造成细胞周期的停滞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 细胞凋亡研究进展
• 1.1 研究历史
• 1.2 细胞凋亡的概念和特征
• 1.3 细胞凋亡的基因调控及相关信息体系
• 1.4 细胞凋亡的检测
• 1.5 细胞凋亡与肿瘤
• 1.6 细胞凋亡的生物学意义
• 参考文献
• 第二章 苏木水提物对K562细胞的诱导分化作用研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 苏木水提物对脐带血单个核细胞的诱导分化
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 新合成化学药物的抗癌活性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附表
• 总结
• 致谢
• 作者简介