基于锁式探针的柑桔溃疡病菌检测新技术研究

论文摘要

柑桔溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease, CBCD)是严重危害世界柑桔种植业的一种细菌性病害,其病原物为地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonos axonopodis pv. Citri, Xac)。长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂,对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播,对病树采取挖除并集中烧毁的根除措施。柑桔非疫区建设的疫情监测和柑桔苗木、果品出入境检疫检验要求快速准确的诊断鉴定技术为支撑。植物疫害生物的检测方法很多,包括症状目测法、病原菌分离培养及致病性测定法、噬菌体检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点免疫结合法(DIA)、DNA杂交诊断法、DNA指纹图谱分析、PCR检测技术等,特别是PCR技术和荧光定量PCR检测技术的应用使植物疫害生物的检验检疫工作有了一种更加快速、准确、灵敏、便捷的检测方法。然而除了PCR技术之外,所有的这些检测技术都只能检测单一的靶标。尽管双重PCR及多重PCR能够进行多靶标检测,但是,不同引物对之间的竞争和相互抑制常常影响到检测的特异性和稳定性,检测体系不易优化。锁式探针(Padlock probe)是一种较长的单链寡核苷酸片段,两个末端和靶标序列毗邻互补,中间的一段连接序列对检测结果没有影响,可以作为通用引物的结合位点。锁式探针这种独特的设计,满足了特异性与多靶标检测的需要,具有多种扩增方式,还能够携带检测标记物,可以适应多种检测平台。研究目的:以重要植物检疫性病害柑桔溃疡病菌为研究对象,利用设计的特异性的锁式探针和滚环扩增技术,构建柑桔溃疡病菌的特异、灵敏的滚环扩增检测技术体系,为进出境植物检验检疫提供新的检测手段;以小麦矮腥黑穗病菌为参比菌株,建立基于锁式探针和反向斑点杂交的植物病原微生物双靶标检测技术体系,为以后的植物病原微生物多靶标检测技术体系的建立奠定坚实的基础。研究方法:分别以柑桔溃疡病菌和小麦矮腥黑穗病菌独有的蛋白基因序列为靶标检测序列,以小鼠保守的Xist基因序列作为锁式探针的通用连接序列,按照锁式探针的设计原则设计锁式探针,并根据锁式探针的连接序列设计探针的通用扩增引物;优化连接体系和程序、外切酶消化体系和滚环扩增体系,建立起柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系,并以常规PCR作为对比,测试滚环扩增检测的特异性、灵敏度;优化实际样品制样技术,通过实际样品的检测以测试柑桔溃疡病菌滚环扩增检测技术的实用性和稳定性;以柑桔溃疡病菌和小麦矮腥黑穗病菌为实验对象,使用基于锁式探针和连接酶依赖性PCR的反向斑点杂交技术,建立起两种病原微生物的多靶标检测体系,并测试该体系的特异性和灵敏度。研究结果:根据设计的锁式探针建立并优化了柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系,该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌,特异性检测结果与常规PCR的相同;对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为10.8 fg/μL,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20 cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。通过改进柑桔溃疡病菌实际样品的制样技术有效的去除了抑制因素对检测结果的影响,并用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的柑桔溃疡病菌实际样品进行了检测,两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。用滚环扩增技术对设计合成的TCK特异性的锁式探针进行了测试,并用常规PCR技术作比较验证,结果表明所设计的TCK特异性的锁式探针只能在TCK基因组DNA或其独有片段的克隆质粒作为模板的体系中被连接环化,并被特异性的扩增,与常规PCR的检测结果相同,因此具有极好的检测特异性。运用基于锁式探针和连接酶依赖性PCR的反向斑点杂交技术,可以特异性的检测出混合样品中的柑桔溃疡病菌和(或)小麦矮腥黑穗病菌保守基因的克隆质粒,对混合样品中柑桔溃疡病菌保守基因的克隆质粒的检测下限为1.08 fg/μL,从而为病原微生物多靶标检测体系的建立奠定了坚实的试验基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 常规检测方法
• 1.2.2 噬菌体检测法
• 1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）和斑点免疫结合法（DIA）
• 1.2.4 DNA 杂交诊断
• 1.2.5 DNA 指纹图谱分析
• 1.2.6 PCR 检测方法
• 1.3 锁式探针
• 1.3.1 锁式探针的结构
• 1.3.2 锁式探针的扩增与检测
• 1.4 滚环扩增技术
• 1.4.1 滚环扩增的种类及主要特征
• 1.4.2 滚环扩增检测的特异性、灵敏度和可重复性
• 1.4.3 滚环扩增优势和不足
• 1.4.4 滚环扩增的应用
• 1.4.4 实时荧光RCA 技术
• 1.4.5 国内外专利授权情况
• 1.5 研究目的和意义
• 1.6 研究内容和技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 1.7 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 主要试剂及培养基
• 2.4 病原微生物基因组DNA 的提取
• 2.4.1 TENS 法提取Xac 基因组DNA
• 2.4.2 CTAB 法提取小麦矮腥黑穗病菌基因组DNA
• 2.5 锁式探针及其扩增引物的设计
• 2.6 滚环扩增检测体系的建立及优化
• 2.6.1 连接及Exonuclease I 酶切消化
• 2.6.2 分支滚环式扩增（HRCA）
• 2.6.3 体系优化
• 2.7 Xac 滚环扩增检测体系性能测试及实际样品的检测
• 2.7.1 滚环扩增检测的特异性
• 2.7.2 滚环扩增检测的灵敏度
• 2.7.3 滚环扩增检测体系的初步应用
• 2.8 连接酶依赖性 PCR（Ligase-dependent PCR, L-PCR）
• 2.8.1 常规PCR
• 2.8.2 Real time L-PCR
• 2.9 反向斑点杂交
• 3 结果
• 3.1 Xac 及 TCK 基因组 DNA 的提取
• 3.2 HRCA 体系的优化
• 3.3 Xac 滚环扩增检测体系性能测试及实际样品的检测
• 3.3.1 滚环扩增检测的特异性
• 3.3.2 滚环扩增检测的灵敏度
• 3.3.3 实际样品的初步检测
• 3.4 Xac 与 TCK 的混合检测
• 3.4.1 TCK 锁式探针性能测试
• 3.4.2 Xac 与TCK 的滚环扩增检测
• 3.4.3 反向斑点杂交
• 4 讨论
• 4.1 锁式探针及其扩增引物的设计
• 4.2 锁式探针-靶标拓扑结构
• 4.3 核酸外切酶I 的作用
• 4.4 热循环连接法
• 4.5 检测样品的处理
• 4.6 实际样品的检测
• 4.7 锁式探针两种扩增方法的等效性
• 4.8 Real-time L-PCR
• 4.9 反向斑点杂交
• 5 结论及后续工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录