我国食源性副溶血性弧菌生物多态性和致病性评价的研究

论文摘要

背景副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,自1950年首次在日本发现后,世界各地均有副溶血性弧菌感染的报道。在我国沿海地区,副溶血性弧菌也是引起食物中毒和急性肠炎的主要病原菌,全面了解其生物多态性和致病性特点,对预防和控制副溶血性弧菌性食物中毒具有重要的意义。目的通过生化反应、耐药性分析、血清型分析、毒力基因检测、分子分型等技术了解和掌握我国食源性副溶血性弧菌的表型特征和基因多态性。通过建立体外致病性模型探索副溶血性弧菌的致病机制,初步建立体外致病性评价方法。方法利用API 20E对国家食源性致病菌监测网上报的500株副溶血性弧菌食品株和135株临床株进行生化鉴定；采用PCR方法进行毒力基因及毒力相关基因的筛选。根据CLSI的推荐,采用微量肉汤稀释法完成实验菌株对8种抗生素的耐药性分析。对71株食品株、135株临床株进行脉冲场凝胶电泳分析,图谱导入BioNumerics软件进行聚类分析。按照GB/T 4789.7-2008中血清分型方法完成实验菌株的血清学检测。根据表型和基因型特征,选取有代表性的20株食品株、14株临床株,在体外与HeLa细胞相互作用,通过Giemsa染色评价其粘附性,利用试剂盒测定乳酸脱氢酶的释放量来评价其细胞毒性,通过抗生素生存实验评价其侵袭能力。结果500株上报的副溶血性弧菌食品株中有5株生化鉴定为非副溶血性弧菌,135株临床株均鉴定为副溶血性弧菌。药敏实验结果显示,495株食品株中对1种或1种以上抗生素耐药的为66株（13.33%）,其中,对氨苄青霉素的耐药率为11.31%,复方新诺明为1.62%,2株对氯霉素耐药,1株对环丙沙星耐药。所有的食品株对头孢噻肟、头孢他啶和庆大霉素均敏感。135株临床株中对1种或1种以上抗生素耐药的为11株（8.15%）,其中,对氨苄青霉素的耐药率为6.67%,2株对复方新诺明耐药,1株对四环素耐药。所有临床株对头孢噻肟、头孢他啶、庆大霉素、环丙沙星、氯霉素均敏感。血清型鉴定结果显示71株食品株检出30种血清型,分属在7个0群,未知为3株,其中,01、05群占46.48%。检出22个K型,未知的有37株菌。135株临床株检出29种血清型,分属在8个O群,以03、04、01群为主,占89.26%。检出22个K型,未知为12株。03：K6血清型为56.30%,O1:K36, O1:K30等少见血清型共9株。PCR方法筛选临床株、食品株的种特异性基因和毒力基因的结果显示,135株临床株的tlh、toxR、gyrB、vpm均为阳性,85.92%的临床菌株tdh和／或trh阳性,tdh、trh的携带率分别为85.19%、2.96%,其中3株菌同时携带两种毒力基因。GS-PCR,PGS-PCR, orf8、HU-α的阳性率分别为66.67%、80.74%、65.19%、66.67%。495株食品株的tlh、toxR、gyrB、vpm均为阳性,tdh、trh的携带率分别为0%、2.08%。71株食品株、135株临床株的脉冲场凝胶电泳结果显示,限制性内切酶Sfi I和NotI的酶切图谱片段集中在30kb-700kb之间,聚类分析发现两种酶分辨效力相近,SfiI的酶切图谱聚类后共分为15个群,其中K群均为临床株,占实验菌株的43.20%,占临床菌株的65.93%。Not I的酶切图谱聚类后共分为15个群,其中B群为优势群,同Sfi I,也均为临床株。食品株的酶切图谱相似度低,临床株聚类分析相似度较高,临床“大流行菌群”菌株与散发菌株被明显分到不同的群中。MPN定量法分离到的78株食品株的核糖体分型结果显示,EcoR I酶切条带数为7-10,分子量范围位于4kb-50kb之间,酶切后呈现64种Ribotyping带型,聚为7个群,最低相似度为39.1%。PFGE酶切条带分子量在25kb-1200kb之间,Sfi I酶切出68个带型,聚为7个群,最低相似度为50.5%；Not I酶切出71个带型,聚为5个群,最低相似度为10.5%。20株食品株、14株临床株致病性评价实验结果显示,13株食品株具有粘附上皮细胞的能力,粘附指数在10左右；9株临床株具有粘附上皮细胞的能力,其中,5株的粘附指数>30。2株携带两种毒力基因和1株不携带毒力基因的菌株粘附阴性。临床株、食品株的细胞毒性无显著性差异。13株临床株具有侵袭能力侵袭率约为1%o-2%o；而只有2株食品株具有侵袭能力。结论我国食源性副溶血性弧菌带毒株极少,但几乎所有的临床菌株都携带毒力基因,tdh、trh与菌株的致病性密切相关。食品株、临床株耐药情况均不严重,除对氨苄青霉素耐药较多外,对绝大部分临床治疗一线药物都敏感。03：K6为我国临床株的优势血清型,而食品株的血清型呈现多样化分布。PFGE分子分型发现两种酶都能对食品株、临床株进行较好的分型,对临床菌株而言,两种酶都能将“大流行菌群”和散发菌株分离开,而且GS-PCR、HU-α用于判定“大流行菌群”比较可靠。6个生蚝样品分离菌株同源性分析结果显示,我国食源性副溶血性弧菌基因型差异较大。体外致病性评价的结果提示,副溶血性弧菌的致病机理比较复杂。粘附能力、细胞毒性、侵袭力在其致病过程中都不可或缺,但临床株的粘附能力和侵袭能力比食品株要强,细胞毒性无显著性差异。粘附能力和细胞毒性与是否携带毒力基因无必然联系,而侵袭性可能与毒力基因有关。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 副溶血性弧菌的表型特征分析
• 一、副溶血性弧菌的生化鉴定
• 二、副溶血性弧菌的耐药性分析
• 三、副溶血性弧菌的血清学分型
• 第二部分 副溶血性弧菌的毒力特征
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三部分 副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第四部分 MPN法分离副溶血性弧菌同源性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五部分 副溶血性弧菌的致病性评价
• 一、副溶血性弧菌的粘附性
• 二、副溶血性弧菌的细胞毒性
• 三、副溶血性弧菌的侵袭性
• 总结
• 参考文献
• 发表的文章
• 附录
• 致谢