论文摘要
目的叶酸是机体必需的微量营养素,参与DNA的甲基化过程,参与DNA、RNA、蛋白质等主要物质的合成,在细胞的代谢、分化和增殖中发挥重要作用,与肿瘤的发生、发展关系密切。近年来研究发现叶酸与结肠癌、胃癌等肿瘤的发生有关,但关于叶酸与宫颈癌关系的研究较少。宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,但宫颈癌的发病机制至今未完全阐明,已明确高危型HPV感染是其主要病因,但并非惟一因素,研究表明叶酸缺乏可能是宫颈癌发生的一个危险因素。关于叶酸缺乏与宫颈癌发生关系的研究结论不尽一致,多数流行病学资料和临床证据显示叶酸缺乏可能使宫颈癌发生风险上升,补充叶酸可能逆转宫颈癌癌前病变,但叶酸在宫颈癌发生、发展中的作用及具体机制如何并不清楚,尚需深入研究。人群研究结合体外实验可进一步明确叶酸与宫颈癌发生、发展的关系,然而目前国内外尚未见关于叶酸对宫颈癌细胞生长影响的实验研究。本研究采用人群研究和体外实验相结合的方法,探讨体内血清叶酸及HPV16与宫颈癌发生、发展的关系,采用Meta分析方法对血清叶酸与宫颈癌关系作一系统综述;同时进行宫颈癌细胞的体外培养,研究不同浓度叶酸对HPV阴性细胞和HPV16阳性细胞的细胞增殖、凋亡的影响以及HPV16 E2、E6基因mRNA表达水平的变化情况,进一步研究叶酸在宫颈癌发生、发展中的作用以及叶酸与HPV16可能的交互作用,为宫颈癌的病因及其机制研究提供新的理论依据,为宫颈癌的防治提供新的线索。方法1、人群研究:采用以医院为基础的病例-对照研究,选择山西省肿瘤医院2005年1月～2005年12月经病理学确诊的宫颈鳞癌新发病例103人作为病例组,对照组由同期就诊的、与病例无血缘关系,在年龄、民族和居住地条件相同或相近的子宫肌瘤患者103人组成。调查收集研究对象的一般情况,同时采集所有研究对象的空腹静脉晨血,应用PCR方法检测HPV16的感染情况、采用RIA方法测定血清叶酸水平。2、Meta分析:检索1990年1月～2007年7月公开发表的有关血清叶酸和宫颈癌发病关系的研究文献,加入本次人群研究结果,使用Meta分析专用软件RevMan4.2对纳入文献进行定量分析。3、体外实验:选择HPV阴性宫颈癌细胞株C33A和HPV16阳性宫颈癌细胞株CaSki进行常规培养,各取对数生长期细胞置于不同浓度叶酸条件下分组培养,①对照组:叶酸浓度为1μg/ml（普通培养基叶酸的浓度）;②叶酸缺乏组:叶酸浓度为0.1μg/ml（以无叶酸培养基调配）;③叶酸实验组:包括6个组,添加的叶酸浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml和2000μg/ml。以MTT法观察叶酸对两种细胞活性的影响,计算细胞生长抑制率和IC50浓度;通过细胞计数,绘制细胞生长曲线来探讨叶酸对两种宫颈癌细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测各组C33A和CaSki的细胞周期时相变化及细胞凋亡情况,同时选择1000μg/ml叶酸实验组和对照组连续培养4天,检测两种细胞在不同时间段的细胞周期时相变化和凋亡情况;以RT-PCR方法检测各组CaSki细胞HPV16 E2、E6 mRNA的表达,同时检测1000μg/ml叶酸实验组和对照组HPV16 E2、E6 mRNA在不同时间段的表达情况。结果1、血清叶酸及HPV16与宫颈癌的关系（1）宫颈癌病例组血清叶酸含量（2.10±1.03 ng/ml）显著低于对照组（3.04±1.99ng/ml）,两者之间的差异有统计学意义（Z=3.98, P<0.001）。按对照组血清叶酸含量的四分位数进行分级分析,发现随着血清叶酸水平降低,宫颈癌发生风险增加（χ2=13.19, P=0.00）,各级OR值的差异具有统计学意义(χ2趋势=12.41, P<0.000)。（2）病例组的HPV16感染率为55.34%,明显高于对照组（31.07%）,差别具有统计学意义,OR值为2.75（95%CI: 1.564.86）。（3）与血清叶酸充足且HPV16阴性相比,血清叶酸缺乏同时感染HPV16者患宫颈癌的危险增加5.79倍（95%CI: 2.6612.63）。2、血清叶酸与宫颈癌关系的Meta分析按照纳入和排除标准,加上本次研究结果,共有6篇病例-对照研究进入Meta分析,纳入文献累计病例882个、累计对照1477个。按血清叶酸含量的四分位数先分成2个水平进行Meta分析,将最高四分位数Q1定义为叶酸不缺乏,低于Q1者视为叶酸水平低,病例组和对照组之间的差异有统计学意义（Z=2.51, P=0.01）,OR值为2.04（95%CI=1.56, 3.57）;进一步对四个等级进行亚组分析,发现随着叶酸水平降低,患宫颈癌的危险性增加,血清叶酸水平最低（Q4）时,病例组和对照组之间的差异具有统计学意义（Z=4.66, P<0.0001）,OR值为2.24（95%CI=1.39, 2.24）。3、叶酸对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响（1）叶酸对两种宫颈癌细胞C33A和CaSki的活性和增殖均有影响。通过MTT法观察到,添加不同浓度叶酸可抑制两种细胞的活性,除了10μg/ml实验组外,其它各叶酸实验组与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）;随着叶酸浓度增加,两种细胞的生长相对抑制率随之上升,呈现剂量效应关系（C33A:r=0.948, p=0.01;CaSki:r=0.895, p=0.006）。但叶酸缺乏对两种细胞的生长情况未见明显影响,与对照组相比,两组的差异无统计学意义（P>0.05）。以目测概率法计算C33A和CaSki的IC50浓度分别为1007μg/ml和986μg/ml。通过绘制细胞生长曲线发现,补充叶酸对两种细胞的增殖均有抑制作用,叶酸浓度超过100μg/ml以上实验组的细胞总数与对照组相比,差别有统计学意义;随着叶酸浓度增加和培养时间延长,叶酸的抑制作用逐渐增大,且有剂量效应关系（C33A:r=0.895, p=0.006;CaSki:r=0.931, p=0.002）。在叶酸缺乏情况下两种细胞的生长均正常,与对照组相比,差异无统计学意义。高浓度叶酸对CaSki细胞活性和增殖的抑制程度略强于C33A,但无明显差别（P >0.05）。（2）叶酸可影响C33A和CaSki细胞周期时相变化和细胞凋亡。添加叶酸使细胞周期各时相的比例发生变化、诱导细胞凋亡,随着叶酸浓度增加,细胞被阻滞于G0/Gl期的比例增加,细胞凋亡愈加明显,细胞凋亡率随之升高,但CaSki的细胞凋亡率上升幅度略高于C33A。叶酸缺乏对C33A和CaSki细胞周期时相变化和细胞凋亡的影响不明显（P>0.05）。选择1000μg/m(l接近两种细胞的IC50浓度)叶酸浓度分析在不同时间段叶酸对C33A和CaSki细胞周期时相变化和细胞凋亡的影响:随着培养时间延长,G0/Gl期细胞的比例增加、细胞凋亡增加,与对照组相比,差异有显著统计学意义（P<0.05）,但CaSki和C33A在相同培养时间下,1000μg/ml叶酸对两种细胞的细胞周期时相变化和细胞凋亡的影响程度无明显差异。（3）叶酸对HPV16 E2、E6 mRNA表达的影响:不同浓度叶酸对CaSki细胞HPV16E2、E6基因mRNA表达水平的影响程度与对照组相似,差别未显示出统计学意义（P>0.05）;经1000μg/ml叶酸处理不同时间后,CaSki细胞HPV16 E2、E6 mRNA的表达水平随着时间延长略有上升趋势,但没有统计学意义（P>0.05）。结论1、机体血清叶酸水平较低可增加宫颈癌发生的危险。2、HPV16感染是宫颈癌发生的危险因素。3、血清叶酸缺乏与HPV16感染在宫颈癌发生中可能存在协同作用。4、补充叶酸可抑制C33A和CaSki细胞增殖,促进细胞凋亡,且随着叶酸浓度增加和培养时间延长,这种作用呈增强趋势,提示叶酸有望应用于宫颈癌的预防和治疗5、叶酸对CaSki细胞HPV16E2、E6基因mRNA的表达水平没有明显影响,提示叶酸可能对已癌变细胞内HPV16病毒转录的影响微弱。6、不同浓度叶酸对HPV阴性和阳性宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响相似,提示叶酸在宫颈癌发生、发展中可能具有独立效应。