顺序性化学诱导促大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化治疗帕金森的实验研究

论文摘要

目的:本研究旨在研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在顺序性化学诱导培养基诱导下向多巴胺（DA）能神经元细胞分化的能力和效率,并将其移植治疗大鼠模型、评价及探讨移植治疗的效果。方法:1:选取SD大鼠,体重约80g,无菌条件下取股骨骨髓,采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法分离、纯化得到BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物。2:诱导第一阶段:第4代BMSCs制成单细胞悬液,调整细胞浓度为106个/L,接种于多聚赖氨酸包被的6孔板中;诱导第二阶段:应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和神经条件培养基（NCM）诱导,共诱导7d;倒置相差显微镜观察细胞的生长和分化行为,细胞免疫荧光方法鉴定分化的神经前体细胞;诱导第三阶段:继续加入成纤维细胞生长因子8（FGF8）、音速波状蛋白（SHH）诱导,诱导7d后,应用RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光方法鉴定诱导后的多巴胺能神经元细胞。3:取成年SD大鼠,制作26只大鼠帕金森病模型,随机分成3组:实验A组移植诱导分化后的多巴胺能神经元细胞;实验B组移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）;实验C组移植PBS做对照。移植后各组大鼠继续单笼喂养8周,每周均行动物旋转检测。每3周每组各取3只大鼠,经麻醉后、多聚甲醛固定后取出脑组织,留取中脑和纹状体部位切片,进行TH的免疫组化染色及多巴胺含量测定。分别比较各组TH蛋白的阳性表达及多巴胺含量分布情况探索黑质纹状体功能修复情况。结果:1,分离培养的贴壁细胞（P4）具有典型的成纤维细胞样形态和BMSCs细胞表面标志。联合bFGF、EGF和NCM诱导1周后在细胞形态上表现与神经元细胞相似,并且表达神经元特异性标志物β-微管蛋白同型三（β-tubulin isotype III TUJ1）,继续联合FGF8和SHH诱导1周后的细胞,表达多巴胺神经元特异性相关基因:Nurr1、AADC、VAMT、DAT和TH。在蛋白水平均表达多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase TH）,并且TUJ1得到更多表达。倒置相差显微镜观察结果显示:诱导分化2周后,细胞逐渐变圆或呈多角形,并伸出一个较长的轴突和一些树突,随着诱导时间的延长,轴突逐渐延长并在细胞之间连成网状。表明体外早期诱导的骨髓间充质干细胞能够定向诱导分化为多巴胺能神经元样细胞。3,大鼠旋转行为检测结果显示:移植后3～8周,实验A组和B组大鼠旋转行为均较对照C组明显降低（P<0.05）,且实验A组低于实验B组（P<0.05）,差异有统计学意义。4,纹状体内多巴胺含量测定显示:实验组脑组织中均含有较多的多巴胺,且实验A组多于实验B组,而对照C组仅见少量多巴胺。5,免疫组织化学染色显示:实验A组组织TH+细胞含量明显多于对照C组,而实验B组的含量较对照实验C组无明显差异。结论:1,联合bFGF、EGF、FGF8、SHH等顺序诱导,能简单有效的将BMSCs向多巴胺能神经元定向分化,所诱导得到的细胞具有多巴胺能神经元的形态和功能特征。2,体外诱导分化多巴胺能神经元期间,我们得到神经前体细胞,是在诱导过程中出现的中间产物,具有以下特点:①能够传810代;②能够随时冻存和复苏;③从神经前体细胞到诱导成DA能神经元细胞只需要68天时间,较大程度缩短诱导时间;④通过传代筛选神经前体细胞,就能有效去除那些不能诱导成多巴胺神经元的BMSCs,从而提高了诱导效率。3,体外诱导分化的多巴胺能神经元移植体内后,能够促进帕金森病大鼠脑纹状体区神经再生,形态结构的修复和功能的恢复。疗效明显优于单纯的BMSCs细胞移植。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 骨髓间充质干细胞神经方向定向分化及其形态、功能鉴定
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 化学性顺序诱导骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 骨髓间充质干细胞源多巴胺能神经元对PD大鼠模型治疗作用的实验研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 致谢