论文摘要
近20年有学者针对哮喘的发病机制提出“卫生假说”。本实验室的前期研究发现给出生第1天的Sprague-Dawley（SD）大鼠注射卵蛋白可明显抑制大鼠成年后的哮喘气道炎症;但是成年后的大鼠在接触变应原后则可被致敏。因此,我们推测上述早期接触预防哮喘发生的作用可能存在“时间窗”现象。为明确不同时间接触变应原对哮喘发病的影响,并探讨调节性T细胞和共刺激分子在其中的作用,我们进行了如下实验。1.不同时间接触变应原对大鼠哮喘模型的影响（与安芸共同完成）将新生SD大鼠随机分为哮喘组、变应原接触组（出生后第3天、第7天和第14天接触组）及正常对照组。变应原接触组大鼠分别于出生后第3天、第7天、第14天皮下注射卵蛋白1 mg（含氢氧化铝5 mg）。大鼠饲养至成年（6周龄）后,除对照组外其它各组均给予卵蛋白致敏和激发。对大鼠肺组织病理切片进行H&E、过碘酸-席夫染色,评价各组大鼠气道炎症的变化,并计数细支气管上皮中黏液细胞的数量。结果发现:出生后第3天、第7天接触组大鼠与哮喘组大鼠相比,气道炎症明显减轻,黏液细胞数量减少（2.29±0.49 vs 3.50±0.76, 1.25±0.46 vs 3.50±0.76, P<0.01）;而第14天接触组大鼠的气道炎症和黏液细胞计数与哮喘组大鼠相比无明显差异（3.00±1.16 vs 3.50±0.76, P>0.05）。2.不同时间接触变应原与成年大鼠脾和胸腺中调节性T细胞的关系利用流式细胞技术检测上述各组大鼠脾和胸腺中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例。利用Real-time PCR技术检测各组大鼠脾和胸腺组织中叉头框P3（forkhead box P3,Foxp3）转录因子mRNA的表达。利用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测各组大鼠血清中白介素10（interleukin-10, IL-10）和转化生长因子β1（transformating growth factorβ1, TGF-β1）的含量。结果显示:出生后第3天、第7天接触组大鼠脾中CD4+CD25+T细胞的比例较正常组显著增加[（13.68±3.54）% vs （7.33±3.39）%, （16.65±4.91）% vs （7.33±3.39）%, P<0.01]。出生后第3天、第7天接触组大鼠脾中Foxp3 mRNA的表达水平与正常组相比显著升高（18.46±5.01 vs 5.49±1.99, 26.37±4.68 vs 5.49±1.99, P<0.01）,并且第7天接触组胸腺中Foxp3 mRNA的表达也较正常组增多（18.73±3.66 vs 11.13±1.75, P<0.05）;但第14天接触组脾中CD4+CD25+T细胞比例及Foxp3 mRNA表达与正常对照组相比,均无统计学差异[（11.04±2.88）% vs （7.33±3.39）%, 8.71±2.19 vs 5.49±1.99, P>0.05]。第3天接触组大鼠血清中TGF-β1较正常对照组增加[（87.30±9.20）μg/L vs （68.03±4.36）μg/L, P<0.05],第7天接触组TGF-β1的均值较正常组也有所增加[（75.05±9.14）μg/L vs （68.03±4.36）μg/L],但差异无显著性（P=0.069）;而第14天接触组的TGF-β1与正常对照组相比无明显差异[（66.41±4.85）μg/L vs （68.03±4.36）μg/L, P>0.05]。各组大鼠血清中IL-10的含量均无显著性差异（P>0.05）。3.不同时间接触变应原后调节性T细胞和共刺激分子CD28在幼年大鼠胸腺和脾中的变化规律新生SD大鼠分为变应原接触组（出生后第7天、第14天接触组）和同龄对照组。变应原接触组分别于出生后第7天、第14天皮下注射卵蛋白1 mg/0.1 mL（含氢氧化铝5 mg）,对照组皮下注射生理盐水0.1 mL。将上述各组大鼠又各分为两组,分别于上述处理后第3天、第6天处死。取胸腺和脾,利用Real -time PCR的方法检测Foxp3和CD28 mRNA的表达水平。结果显示:出生后第7天接触组在注射卵蛋白后第6天,胸腺中Foxp3和CD28 mRNA表达同时较对照组显著增加（7.1±1.7 vs 4.0±1.6, 224.6±78.8 vs 125.6±63.5, P<0.05）。第14天接触组胸腺中Foxp3和CD28 mRAN与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。而第14天接触组在脾中Foxp3 mRNA的表达与对照组相比显著减少（3.9±1.5 vs 6.8±2.6, P<0.05）,脾中CD28 mRNA则显著增加（33.2±5.7 vs 13.5±1.6, P<0.01）。结论:1.在SD大鼠哮喘模型中,早期变应原接触对预防哮喘的发生有保护作用,且该作用存在“时间窗”现象。“时间窗”大约在大鼠出生后2周以内。2.早期变应原接触可能通过诱导产生调节性T细胞,来抑制成年后哮喘的发生;“时间窗”现象可能与不同时间接触变应原能否诱导机体产生调节性T细胞有关。3.在“时间窗”内接触变应原可能通过上调胸腺中CD28信号通路来诱导调节性T细胞的生成;而在“时间窗”外接触变应原则可能使T细胞活化,并且抑制调节性T细胞的产生及功能。