现代分析技术应用于防风药效物质基础研究

论文摘要

中药药效物质基础研究是实现中药现代化的主要内容和关键问题之一。本论文以防风为研究对象,运用多种现代分析技术,从体外、体内多个层次,建立了一系列中药材药效物质基础研究的方法。多成分含量测定能严格的控制中药中有效成分或指标性成分的含量,而指纹图谱则用代表中药物质基础的化合物群来评价中药质量,采用HPLC-TOF/MS等现代分析联用技术对指纹图谱中的色谱峰进行鉴别,并对血浆、尿液中药材的相关成分进行鉴别,帮助我们进行药效物质的筛选和机理研究。中药药代动力学研究得到主要成分在体内的动态变化过程,也为我们研究中药药效物质基础提供了视角,为阐明中药的组方原理、作用机制提供很好的指导作用。本课题采用HPLC-TOF/MS技术对防风药材中的化学成分进行定性鉴别。利用飞行时间质谱的精确分子量测定,比对化合物数据库,共鉴别32个成分,包括8个色原酮类成分和14个香豆素类成分。将HPLC-TOF/MS技术与化学计量学方法相结合,用于鉴别与区分不同产地来源的防风药材,并找到对不同类别的防风药材起主要分类作用的特征性成分,如5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、升麻苷、3’-O-当归亥茅酚、亥茅酚苷、5-O-甲基维斯阿米醇和石防风素均为关防风（道地防风）的标志性成分。该法为阐明中药材质量差异提供了有效的方法,并为药材的质量控制提供参考。采用HPLC-TOF/MS技术进一步鉴别了防风血浆、尿液中相关成分及代谢产物。结果表明,防风的主要入血成分为升麻素,而药材中含量最高的升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷入血量极微,说明单以升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷为检测标准的体外药材质控方法不够合理完善,药材中升麻素的含量亦十分重要,为探索防风可能的药效成分及其体内代谢过程奠定基础。根据药材体外,体内成分鉴别结果,建立了防风中四种色原酮类成分升麻苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的HPLC-DAD含量测定方法,对该方法进行了系统的方法学验证,结果表明该方法可用于防风中4个色原酮类成分的含量测定,并应用于10批防风药材的测定。该方法灵敏度高、稳定性好、价格低廉、通用性强,可用于防风的常规质量控制,为进一步的药理研究及中药药效物质研究提供依据。为进一步研究防风主要成分在体内的吸收、代谢过程,建立了大鼠血浆中升麻苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷的HPLC-MS测定方法,并对其进行药代动力学研究。3个成分的线性范围分别为12.99～230.5 ng·mL-1; 12.81～24350 ng·mL-1;13.42～124.25 ng·mL-1,其低、中、高浓度水平的绝对回收率均在94%～104%之间；精密度RSD均小于15%；稳定性实验结果亦符合要求。血浆中内源性物质均不干扰样品峰的测定。该法简便可靠,适合于生物样品中三者的含量测定,并成功应用于SD大鼠口服给药防风水煎液和升麻苷单体的药代动力学研究。比较大鼠灌胃给药防风水煎液,升麻苷单体水溶液后升麻苷和升麻素的药时曲线,可见大鼠灌胃给药防风水煎液的药动学参数（AUC0-t,AUC0-∞和MRT）与单独给药升麻苷单体水溶液后的参数有显著差异性（P<0.05）,且升麻苷大量转化为升麻素吸收入血。给药防风水煎液后3个成分的药时曲线均出现双峰现象,而给药升麻苷单体得到的药时曲线均为单峰,且代谢较快。这些结果提示了在成分吸收入血时发生了转化反应,且可能存在肝肠循环。中药质量控制同时对升麻苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷进行测定是必要的,对临床合理用药以及防风的后续药理研究具有指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 HPLC-TOF/MS与化学计量学方法结合鉴别防风化学成分及产地分析
• 第一节 HPLC-TOF/MS鉴别防风中化学成分
• 1 仪器与试剂
• 2 方法与结果
• 2.1 供试品的制备
• 2.2 液相色谱条件
• 2.3 TOF/MS质谱条件
• 2.4 防风中化学成分定性分析结果
• 3 讨论
• 3.1 防风提取方法的优化
• 3.2 色谱与质谱条件的优化
• 4 小结
• 第二节 HPLC-TOF/MS结合化学计量学方法用于防风来源分析与质量控制
• 1 仪器试剂和样品
• 2 实验方法
• 2.1 供试品的制备
• 2.2 色谱及质谱条件
• 2.3 数据分析
• 3 结果和讨论
• 3.1 数据的采集
• 3.2 仪器稳定性和方法重现性的考察
• 3.3 质谱条件的优化
• 3.4 主成分分析
• 3.5 偏最小二乘判别分析与标志物的寻找
• 4 小结
• 第二章 HPLC-TOF/MS鉴别防风提取物大鼠给药后血浆,尿液中成分及代谢产物
• 1 仪器与材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 防风中升麻苷,升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷的药代动力学研究
• 1 仪器与试药
• 2 灌胃药液的制备
• 2.1 灌胃药材提取物的制备
• 2.2 灌胃升麻苷单体水溶液的制备
• 3 试验设计
• 4 血浆样品的处理方法
• 5 HPLC-MS条件
• 5.1 色谱条件
• 5.2 质谱条件
• 6 方法学验证
• 6.1 方法特异性
• 6.2 标准曲线与线性范围
• 6.3 检测限与定量限
• 6.4 精密度和准确度
• 6.5 回收率试验
• 6.6 稳定性
• 6.7 随行标准曲线和质量控制
• 6.8 基质效应
• 7 数据处理
• 8 实验结果
• 9 讨论
• 9.1 分析方法的优化
• 9.2 药动学结果讨论
• 10 小结
• 参考文献
• 致谢