电针治疗大鼠胃溃疡模型的效应与肥大细胞的相关性研究

论文摘要

根据中医经络学说,耳为宗脉之所聚,六阳经都直接或间接地上耳前或耳中,六阴经则通过与阳经的络属关系,间接地与耳发生联系。脏腑的生理或病理活动均可通过经络反映于耳。足三里是胃经的合穴,也是下合穴,“合治内府”,是治疗胃腑病的常用首选穴位,具有和胃健脾,降逆调中之功。大量临床和动物实验观察均证实针刺“耳胃”穴及“足三里”穴对胃溃疡有明显疗效。但其治疗的作用机理至今尚未甚明,以致影响防治效果。目的:研究电针“耳胃”及“足三里”穴治疗实验性胃溃疡过程中,穴区肥大细胞（mast cells,MCs）和腹腔MCs（Peritoneal MCs,PMCs）的功能变化与疗效的相关性。方法:实验均采用清洁级Wistar大鼠,雌雄各半,由中国医学科学院实验动物中心提供。①形态学及电生理学实验:将40只大鼠（体重150—220g）随机分为对照组、模型组、电针组和模型测导电量组（简称导电量组）。后3组首先采用1ml注射器在胃窦前壁肌层与浆膜层之间注入0.05ml 20%冰醋酸的方法制作胃溃疡模型。电针组动物在手术后4h电针（2/15HZ,1mA,30min）双侧“耳胃”穴和“足三里”穴,电针前用HB-EDT-A穴位诊断治疗仪（河北威海医用电子仪器有限公司）测定1次“耳胃”穴导电量,然后隔2h再测定1次。以后每天电针前测定1次,至造模后7d。导电量组大鼠在胃溃疡造模术后不进行电针,但耳穴测定与电针组同时进行。7天后分别取4组大鼠“耳胃”及“足三里”穴区组织恒冷箱切片,乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AchE）组化染色并用甲苯胺兰（toluidine blue,TB）复染,显示穴区真皮至皮下组织MCs的分布、数量和脱颗粒情况。取胃窦前壁含溃疡胃组织石蜡包埋,切片后行苏木精—伊红（hemotoxylin-eosin,HE）染色。②PMCs的收集和培养及流式细胞仪检测:a PMCs的收集及离心:40只大鼠（体重约200g）经麻醉,腹部去毛,消毒后,切开腹部,在无菌条件下收集腹腔冲洗液,并离心（1000r/min,4℃）10min,弃上清液,取其细胞悬液,沿管壁缓慢加入盛有PMCs分离液的离心管中,使两液形成界面,然后离心（2500r/min,4℃）15min,弃上清液,取底部PMCs,用冷的无Ca2+、Mg2+的PBS离心清洗2次（1000r/min 4℃）共20min,弃上清液。b PMCs的培养和血清的制备:取底部PMCs,TB染色,光镜下计数,调PMCs浓度至106个/ml,PMCs纯度大于95%以上,台盼蓝染色,活力大于95%,并置于含10%小牛血清的RPMI-1640孵育液中悬浮备用将30只大鼠（体重约200g）随机分为对照组、模型组和电针组（3组大鼠的相应处理均按照形态学实验中的方法,但电针组不再测耳穴导电量）,7天后分别在3组大鼠的颈动脉取血,将血液移入离心管中,37℃下静置2h,在常温下离心（2500r/min）10min,用吸管小心吸取血清,将同组血清混合,过滤除菌,分装后—20℃冻存备用。c PMCs脱颗粒率的流式细胞仪分析:在PMCs悬液中,分别加入3组大鼠的血清（PMCs悬液与血清之比为1:1）,置37℃、5%CO2培养箱内共孵育2h,4℃终止反应,用冷的无Ca2+、MG2+的PBS离心清洗2次（1000r/min 4℃）共10min,弃上清液,取底部PMCs,用100μl Annexin-V荧光标记液（1ml孵育缓冲液+20μlAnnexin-V荧光标记素+20μl Propidium碘化液）悬浮,并在15-25℃孵育10-15min,采用ELITE-型流式细胞仪计数Annexin V荧光阳性细胞数（即为PMCs的脱颗粒率）。结果:①形态学实验:对4组大鼠的穴区真皮至皮下组织MCs进行对比观察,其中模型组MCs总数量均明显多于导电量组、电针组和对照组,导电量组MCs总数量又明显多于电针组和对照组,电针组又多于对照组。统计学处理结果显示,4组间存在非常显著性差异（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。通过对各组穴区内MCs脱颗粒率进行统计学处理,结果表明模型组MCs脱颗粒率明显高于导电量组、电针组和对照组,导电量组细胞脱颗粒率也明显高于电针组和对照组,电针组高于对照组,且4组间均存在非常显著性差异（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。HE染色结果显示:对照组胃窦前壁粘膜面完整无缺损;而模型组胃窦前壁粘膜面有很明显的溃疡缺损,已明显超过粘膜肌层;电针组胃窦前壁粘膜面稍有缺损,尚未达粘膜肌层;导电量组胃窦前壁粘膜面的溃疡缺损介于模型组与电针组之间。②电生理学实验:导电量组及电针组大鼠术后“耳胃”穴导电量皆较手术前显著升高,电阻值降低。但电针组于第1次电针后导电量即不再升高,维持在术后第1次测定的水平;导电量组大鼠术后耳穴导电量却继续升高,并持续3～5天,第6天后开始下降;两组的耳穴导电量升高从第1次电针后即表现出组间显著性差异,第7天后才逐渐接近。③PMCs脱颗粒率的流式细胞仪检测:模型血清组PMCs的脱颗粒率明显高于电针血清组和对照血清组,电针血清组PMCs的脱颗粒率明显高于对照血清组,统计学处理结果显示3组间均有非常显著性差异（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。结论:①在穴区MCs较多,并多沿神经和血管分布,特别在小血管周围较密集,说明MCs确实与穴位反应和针刺效应相关。②相关穴区MCs数量及脱颗粒率的变化与实验性胃溃疡的发生呈正相关性,这为体表脏腑相关的理论提供实验依据。③电针治疗实验性胃溃疡的作用,与穴区MCs的数量减少和脱颗粒率的降低密切相关,针刺血清对PMCs脱颗粒有直接抑制作用,表明针刺效应的产生与神经、免疫和体液等多种因素有关。④MCs与穴位低电阻有一定相关性,为临床应用耳穴诊治相关疾病提供了可参考的科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 针灸效应与经穴肥大细胞相关性研究概况
• 1 MCs的简介
• 1.1 MCs的形成、分布、分型及其特征
• 1.2 MCs脱颗粒及其生物学效应
• 2 MCs与经穴的密切相关性
• 2.1 经穴处MCs的形态学分布特征
• 2.2 针灸对经穴处MCs数目及脱颗粒的影响
• 3 经穴处MCs与循经感传机制的相关性
• 4 针灸治疗I型超敏反应与MCs的相关性
• 5 针刺耳穴及体穴治疗胃溃疡的临床观察与基础研究
• 6 小结与展望
• 前言
• 第一部分 形态学及电生理学实验
• 1.材料和方法
• 1.1 动物与分组
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 实验方法
• 1.6 取材、固定、切片并染色
• 1.7 TB及AchE组化实验方法
• 1.8 HE染色方法
• 1.9 脱颗粒MCs的计数和统计处理
• 2 实验结果
• 2.1 术后大鼠观察
• 2.2 "耳胃"及"足三里"穴区真皮至皮下组织MCs数量及脱颗粒现象
• 2.3 电生理学实验结果
• 第二部分 PMCS的收集和培养及流式细胞仪检测
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要溶液的配制
• 1.5 PMCs收集及离心
• 1.6 PMCs的培养和血清的制备
• 1.7 PMCs脱颗粒率的流式细胞仪分析
• 1.8 脱颗粒PMCs的计数和统计处理
• 2 实验结果
• 讨论
• 下一步实验设想
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表文章情况
• 致谢
• 个人简历