奇异变形杆菌可移动耐药基因岛研究

论文摘要

随着奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）耐药菌株不断增加,其耐药机制成为研究人员关注的热点。沙门氏基因组岛（Salmonella Genomic Island 1, SGI1）作为细菌编码抗性的可移动元件,于2007年在P. mirabilis菌株中发现,它在细菌多重耐药基因传播和转移过程中发挥重要的作用。本论文主要研究P. mirabilis中SGI1介导耐药基因的水平传播。通过对广州市天河区食品和临床P. mirabilis菌株的分离,研究这些菌株对17种常用抗生素的耐药性以及Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子,耐药基因盒的携带情况。采用PFGE方法分析Ⅰ类整合子阳性菌株、Ⅱ类整合子阳性菌株的同源性以及携带相同耐药基因盒菌株间的亲缘关系。结合耐药基因盒信息,对P. mirabilis分离株中SGI1的携带情况、基因岛的结构与序列进行解析,结果如下:使用传统分离培养法和建立的靶基因为tuf基因的变形杆菌属PCR方法对肉类产品中分离的可疑菌株和P. mirabilis临床分离株进行鉴定,PCR方法和生化实验结果完全一致,从食品中分离到14株P. mirabilis菌株并验证了46株P. mirabilis临床分离株的准确性。46株P. mirabilis临床分离株普遍具有多重耐药性,其中耐10种以上抗生素高达69.6%。14株P. mirabilis食品分离株均耐5种以下抗生素,28.6%耐3-5种抗生素。氯霉素、四环素、红霉素、复方新诺明抗菌药物不适合治疗本地区P. mirabilis引起的感染。头孢曲松、头孢西丁的敏感率达到88.3%～91.7 %,可作为首选药物。Ⅰ类整合子阳性菌株34株（56.7%）,其中,4株携带blaP1和aadA2基因盒,对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药;19株携带dfrA17和aadA5基因盒,对磺胺类和氨基糖苷类药物耐药;3株分别携带blaP1、dfrA1和aadB基因盒;8株携带dfrA5基因盒。17株（28.3%）菌株携带Ⅱ类整合子和dfrA1、sat2、aadA1基因盒,其中16株（94.1%）携带Ⅰ类整合子且均携带dfrA17和aadA5基因盒,Ⅰ、Ⅱ类整合子阳性率为26.7%。没有检测到Ⅲ类整合子。56株P. mirabilis成功分型,相似值为0.40～1.00。12组,42株P. mirabilis的脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）图谱分别相同,表明在病原学上具有同源性,为克隆相关菌株。同时携带Ⅰ类和Ⅱ类整合子的菌株同源性很高,相似值约0.72～1.00。2株P. mirabilis临床分离株分别携带SGI1-B和SGI1-O。4株P. mirabilis临床分离株携带SGI1,且这4株为克隆相关菌株。5株P. mirabilis临床分离株和3株P. mirabilis食品分离株携带一种新型基因岛变异体SGI1-U,且为相同克隆菌株,提示了该岛从食源到人类水平传播的可能性。前三种基因岛均位于染色体thdF和hipB基因间,而SGI1-U染色体缺失了hipB和hipA基因,插入在thdF和PMI3124基因之间。综上所述,P. mirabilis菌株携带多种SGI1且携带率很高,研究结果为流行病学研究提供了依据,为了解细菌多重耐药性获得和传播机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 奇异变形杆菌的特性与检测
• 1.1.1 P. mirabilis 的特性
• 1.1.2 P. mirabilis 的检测
• 1.2 脉冲场凝胶电泳（PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS, PFGE）
• 1.2.1 分型技术的研究进展
• 1.2.2 PFGE 方法原理
• 1.2.3 PFGE 结果的解释
• 1.2.4 PFGE 在分子生物学中的应用
• 1.2.5 PFGE 方法的局限和不足
• 1.2.6 PulseNet
• 1.3 细菌药物敏感性试验
• 1.3.1 药敏试验方法
• 1.3.2 药敏实验的选药原则
• 1.4 细菌耐药的分子机制
• 1.4.1 细菌耐药的生物化学机制
• 1.4.2 细菌耐药的遗传学机制
• 1.5 细菌编码抗性的可移动遗传元件
• 1.5.1 质粒
• 1.5.2 转座子
• 1.5.3 整合子系统
• 1.5.4 基因组岛
• 1.6 沙门氏一类基因组岛（SALMONELLA GENOMIC ISLAND 1, SGI1）
• 1.6.1 SGI1 的结构
• 1.6.2 SGI1 的变异体与耐药性
• 1.6.3 SGI1 的移动性
• 1.7 细菌耐药性由动物向人类的传播
• 1.7.1 动物源性耐药菌对食品和环境的污染
• 1.7.2 动物源性细菌耐药性向人类的传播
• 1.8 本课题的研究意义及主要内容
• 第二章 奇异变形杆菌的分离鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 培养基与试剂
• 2.2.3 培养基和常用溶液配制
• 2.2.4 实验菌株
• 2.2.5 样品来源
• 2.3 实验流程
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 样品处理
• 2.4.2 增菌培养
• 2.4.3 分离平板
• 2.4.4 PCR 检测变形杆菌
• 2.4.5 生化鉴定
• 2.4.6 菌株保存
• 2.5 实验结果
• 2.5.1 PCR 引物
• 2.5.2 食品中可疑菌株的PCR 检测
• 2.5.3 P. mirabilis 临床分离株的PCR 鉴定
• 2.5.4 食品中可疑菌株的生化试验
• 2.5.5 P. mirabilis 临床分离株的生化鉴定
• 2.6 本章小结
• 第三章 奇异变形杆菌的耐药表型分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 培养基与试剂
• 3.2.3 实验菌株
• 3.2.4 培养基和常用溶液配制
• 3.3 实验流程
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 麦氏比浊管的制备
• 3.4.2 接种菌液的准备
• 3.4.3 药敏试验
• 3.4.4 结果判读
• 3.4.5 影响结果的因素
• 3.4.6 抗菌药物敏感试验的质量控制
• 3.5 实验结果与讨论
• 3.5.1 抗生素的选用
• 3.5.2 质控菌株的药敏实验
• 3.5.3 药敏实验结果
• 3.5.4 耐多药结果分析
• 3.5.5 P. mirabilis 分离株耐药模式分析
• 3.6 本章小结
• 第四章 奇异变形杆菌整合子系统基因检测及序列分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要仪器设备
• 4.2.2 培养基与试剂
• 4.2.3 实验菌株
• 4.2.4 培养基和常用溶液配制
• 4.3 实验流程
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 DNA 模板的制备（CTAB 法）
• 4.4.2 Ⅰ类整合酶基因intI1 的扩增
• 4.4.3 Ⅰ类整合酶基因intI1 扩增产物的电泳鉴定
• 4.4.4 Ⅰ类整合子携带耐药基因盒的扩增
• 4.4.5 Ⅰ类整合子携带耐药基因盒扩增产物的凝胶电泳
• 4.4.6 Ⅰ类整合子携带耐药基因盒扩增产物序列分析
• 4.4.6.1 PCR 产物的纯化
• 4.4.6.2 TA 克隆
• 4.4.6.3 大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞的制备
• 4.4.6.4 大肠杆菌的转化实验
• 4.4.6.5 DNA 测序及序列解析
• 4.4.7 Ⅱ类整合酶基因intI2 的扩增
• 4.4.8 Ⅱ类整合酶基因intI2 扩增产物的电泳鉴定
• 4.4.9 Ⅱ类整合子携带耐药基因盒的扩增
• 4.4.10 Ⅱ类整合子携带耐药基因盒扩增产物的凝胶电泳
• 4.4.11 Ⅱ类整合子携带耐药基因盒扩增产物序列分析
• 4.4.12 Ⅲ类整合酶基因intI3 的扩增
• 4.4.13 Ⅲ类整合酶基因intI3 扩增产物的电泳鉴定
• 4.5 实验结果与讨论
• 4.5.1 整合子的结构和分类
• 4.5.2 Ⅰ类整合酶基因intI1 的扩增
• 4.5.3 Ⅰ类整合子携带耐药基因盒扩增
• 4.5.4 Ⅰ类整合子携带耐药基因盒序列解析
• 4.5.5 Ⅱ类整合酶基因intI2 的扩增
• 4.5.6 Ⅱ类整合子携带耐药基因盒扩增及序列解析
• 4.5.7 Ⅲ类整合酶基因intI3 的扩增
• 4.6 本章小结
• 第五章 奇异变形杆菌的基因指纹图谱分析
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 主要仪器设备
• 5.2.2 培养基与试剂
• 5.2.3 培养基和常用溶液配制
• 5.2.4 菌株
• 5.3 实验流程
• 5.4 实验方法
• 5.4.1 胶块的制备
• 5.4.2 细胞的裂解
• 5.4.3 洗胶块
• 5.4.4 胶块内DNA 的酶切
• 5.4.5 制备大胶、上样
• 5.4.6 电泳
• 5.4.7 染色、凝胶成像
• 5.4.8 结果分析
• 5.5 实验结果与讨论
• 5.5.1 P. mirabilis 分离株的同源性分析
• 5.5.2 Ⅰ类整合子阳性P. mirabilis 分离株的PFGE 分析
• 5.5.3 Ⅱ类整合子阳性P. mirabilis 分离株的PFGE 分析
• 5.5.4 携带aadA2 和blaP1 基因盒的P. mirabilis 分离株同源性分析
• 5.5.5 携带dfrA5 基因盒的P. mirabilis 分离株同源性分析
• 5.5.6 携带dfrA17 和aadA5 基因盒的P. mirabilis 分离株同源性分析
• 5.6 本章小结
• 第六章 奇异变形杆菌耐药基因岛SGI1 分析
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 主要仪器设备
• 6.2.2 培养基与试剂
• 6.2.3 实验菌株
• 6.2.4 培养基和常用溶液配制
• 6.3 实验流程
• 6.4 实验方法
• 6.4.1 DNA 模板的制备（CTAB 法）
• 6.4.2 P. mirabilis 菌株染色体中SGI1 的检测
• 6.4.3 P. mirabilis 菌株SGI1 的MDR 区结构序列分析
• 6.4.4 P. mirabilis 菌株SGI1-B 的MDR 区结构序列分析
• 6.4.5 P. mirabilis 菌株SGI1-O 的MDR 区结构序列分析
• 6.4.6 P. mirabilis 菌株SGI1-U 的MDR 区结构序列分析
• 6.4.7 P. mirabilis 菌株SGI1-U 右侧结构解析
• 6.4.8 SGI1 阴性、Ⅰ类整合子阳性P. mirabilis 的MDR 结构序列分析
• 6.5 结果与讨论
• 6.5.1 P. mirabilis 菌株SGI1 检测
• 6.5.2 P. mirabilis 菌株SGI1 类型的初步分析
• 6.5.3 P. mirabilis 菌株SGI1 的MDR 区结构序列分析
• 6.5.4 P. mirabilis 菌株中SGI1-B 的MDR 结构序列分析
• 6.5.5 P. mirabilis 菌株SGI1-O 的MDR 结构序列分析
• 6.5.6 P. mirabilis 菌株SGI1-U 的MDR 结构序列分析
• 6.5.7 P. mirabilis 菌株SGI1-U 右侧结构解析
• 6.5.8 携带SGI1-U 的P. mirabilis 菌株hipB 和hipA 基因缺失分析
• 6.5.9 SGI1 阴性、Ⅰ类整合子阳性P. mirabilis 的MDR 结构序列分析
• 6.5.10 GenBank 序列号
• 6.6 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢