水杨酸和茉莉酸甲酯诱导青蒿素合成基因表达的机理研究

论文摘要

疟疾是全球危害人类健康最严重的虫媒传染病,广泛流行于热带和亚热带一些发展中国家。传统抗疟药氯喹等因疟原虫产生抗性而逐步被淘汰,青蒿素及其衍生物已成为WHO指定的抗疟特效药。但是,天然药用植物青蒿中青蒿素的含量极低,约为0.4%-1.0%,因而不能满足广大疟疾流行地区对抗疟药的迫切需求。为了探讨青蒿素高产的分子机理,本研究从环境胁迫诱导青蒿素合成基因表达角度出发,利用紫穗槐二烯合酶基因启动子-β-葡萄糖苷酸酶（pADS-GUS）转基因烟草表型快速鉴定平台揭示了pADS的诱导表达模式。结果发现,经水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MJ）处理后,GUS活性显著增强,表明SA、MJ都能诱导ADS基因表达。在此基础上,我们利用半定量RT-PCR技术研究了SA、MJ对3种青蒿素合成基因转录水平的影响,结果发现ADS基因受MJ、SA诱导,CYP71AV1、CPR基因不受SA、MJ诱导。为了了解SA、MJ信号转导是否与钙离子（Ca2+）有关,我们利用半定量RT-PCR技术研究了SA、MJ联合Ca2+通道阻滞剂氯化镧（LaCl3）处理青蒿试管苗后青蒿素合成基因转录水平的变化。结果发现,处理后ADS mRNA降低,而CYP71AV1、CPR mRNA无明显变化,表明Ca2+仅影响SA、MJ对ADS基因表达的诱导。进一步研究发现,SA、MJ处理青蒿试管苗后,青蒿叶片组织释放的1O2迅速增加,而用1O2供体虎红（RB）处理青蒿试管苗后,青蒿叶片组织释放的1O2不升反降。青蒿素含量测定结果显示,SA、MJ处理可以明显提高青蒿试管苗的青蒿素含量。相反,RB处理导致青蒿素含量降低,表明仅有内源1O2而不是外源1O2可促进青蒿素合成。同时也发现,SA、MJ使青蒿试管苗中的谷胱甘肽（GSH）含量、H2O2水平和过氧化氢酶（CAT）活性相应增加,导致青蒿素合成基因表达诱导,最终促进青蒿素产量提高。本研究的创新点包括：（1）发现SA、MJ可以模拟环境胁迫促进青蒿素合成；（2）证实SA、MJ可以诱导青蒿素合成基因表达；（3）阐明SA、MJ可以影响细胞的氧化还原状态；（4）区分内源与外源1O2及其在青蒿素合成中的作用。本研究从分子水平阐明了SA、MJ促进青蒿素高产的作用机理,有助于科学指导青蒿的种植、田间管理、收获和加工等青蒿素生产环节,为缓解青蒿素原料紧缺开辟一条新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 正文
• 第一章 国内外研究综述
• 一、青蒿素的发现及来源
• （一） 青蒿素的发现及历史
• （二） 青蒿素的来源
• 二、青蒿素生物合成前体研究现状
• （一） 青蒿酸
• （二） 青蒿素B
• （三） 青蒿烯
• 三、青蒿素的生物合成路径及合成途径中的关键酶
• （一） 青蒿素生物合成途径
• （二） 青蒿素生物合成途径的关键酶及编码的基因
• 四、青蒿素高产的研究
• （一） 影响青蒿素产量的因素
• （二） 提高青蒿素产量的手段
• 五、次级信号诱导植物次生代谢产物的研究概况
• 六、研究目的及意义
• 七、创新思路与设计方案
• 第二章 青蒿素合成基因启动子诱导的表型鉴定
• 一、材料
• （一） 植物材料
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、实验方法
• （一） SA、MJ处理转化烟草
• （二） GUS组织化学染色法
• （三） 化学分光光度法
• 三、结果
• （一） GUS基因表达的定性鉴定
• （二） GUS基因表达的定量测定
• 四、讨论
• 2+相关性'>第三章 SA/MJ诱导青蒿素生物合成基因及其Ca²⁺相关性
• 一、材料
• （一） 植物材料
• （二） 主要试剂
• 二、实验方法
• （一） SA、MJ处理青蒿植株
• 3处理青蒿植株'>（二） SA、MJ联合LaCl₃处理青蒿植株
• （三） 青蒿素合成基因的半定量分析
• 三、结果
• （一） SA/MJ对ADS、CYP71AV1基因的诱导
• （二） SA/MJ对CPR基因的诱导
• 2+对SA、MJ诱导ADS基因的影响'>（三） Ca²⁺对SA、MJ诱导ADS基因的影响
• 2+对SA、MJ诱导CYP71AV1基因的影响'>（四） Ca²⁺对SA、MJ诱导CYP71AV1基因的影响
• 2+对SA、MJ诱导CPR基因的影响'>（五） Ca²⁺对SA、MJ诱导CPR基因的影响
• 四、讨论
• 1O₂供体对内源¹O₂释放的影响'>第四章 SA/MJ及外源¹O₂供体对内源¹O₂释放的影响
• 一、材料
• （一） 植物材料
• （二） 主要试剂
• （三） 仪器
• 二、实验方法
• （一） SA、MJ处理青蒿植株
• （二） RB处理青蒿植株
• 1O₂的检测'>（三）¹O₂的检测
• 三、结果
• 1O₂释放的时间进程'>（一） SA、MJ刺激¹O₂释放的时间进程
• 1O₂释放的时间进程'>（二） RB处理刺激¹O₂释放的时间进程
• 四、讨论
• 1O₂在青蒿素合成中的作用'>第五章 内源及外源¹O₂在青蒿素合成中的作用
• 一、材料
• （一） 植物材料
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、实验方法
• （一） 青蒿试管苗的预处理
• （二） 样品制备
• （三） 青蒿素含量测定
• 三、结果
• （一） SA、MJ处理对青蒿素含量的影响
• （二） RB处理对青蒿素含量的影响
• 四、讨论
• 第六章 SA和MJ对活性氧水平的调控
• 一、材料
• （一） 植物材料
• （二） 主要试剂
• （三） 仪器
• 二、实验方法
• （一） GSH含量的测定
• （二） CAT活力的测定
• 2O₂的检测'>（三） H₂O₂的检测
• 三、结果
• （一） SA、MJ对组织中GSH水平的影响
• （二） SA、MJ对CAT活力的影响
• 2O₂含量的影响'>（三） SA、MJ处理对组织中H₂O₂含量的影响
• 四、讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢