论文摘要
背景和目的:血管内膜增生是动脉血管对各种损伤的一种反应,也是动脉粥样硬化和经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）术后再狭窄的重要标志。血管平滑肌细胞（ vascular smooth muscle cell,VSMC）被各种损伤刺激激活后,由静息状态转变为增殖表型并移行到内膜下,参与合成各种细胞外基质,在内膜增生形成过程中具有重要作用。越来越多的证据表明感染和各种组织损伤能够通过诱导先天免疫反应,促进动脉壁的炎症,在VSMC激活和血管内膜增生过程中具有重要作用。但这些免疫反应调节和相互作用的分子生物学机制还不是很清楚。模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）是一种经过广泛选择的种系编码的受体,它们通过识别病原体关联的分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）来感知侵入机体的危险信号。它们与其它免疫组份一起构成了机体的第一道防线。Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）和核苷酸结合的寡聚结构域（nucleotide- binding oligomerization domain,NOD）受体是近期确定的参与炎症疾病的两个PRRs家族。TLRs主要位于细胞表面,识别来源于细胞外部的危险信号。细菌为了避免被清除已经发展出一些侵入和通过上皮层的对策。在侵入上皮下间隙后,细菌还可以遭遇到吞噬细胞的局部抵抗,但是细菌能够利用各种对策避免被吞噬细胞的溶酶体吞食和降解而侵入细胞内。NOD受体是一种功能上与TLR相似,但位于细胞胞质溶胶的蛋白家族,它们能识别侵入细胞内的细菌产物,负责识别侵入细胞内的危险信号,启动免疫反应,代表了细胞内的一种防御监测手段。TLRs和NOD受体都具有一个富含亮氨酸的重复结构域（leucine–rich repeat domain,LRR）,负责与特异的PAMPs结合。TLRs和NOD受体被激活后能启动下游衔接分子的级联反应,激活NF-κB信号传导通路,启动炎症细胞因子和其它先天免疫反应成分的转录,在清除病原感染的炎症反应中起着重要作用。NF-κB信号传导通路的激活介导了许多炎症因子的表达,这些炎症因子参与血管损伤炎症反应,在VSMC增殖、分化和凋亡的过程中起到重要的调节作用,由此推测TLRs和NOD受体介导的信号传导通路可能在血管内膜增生和VSMC激活过程中起到重要作用。本研究利用大鼠颈总动脉狭窄这一经典动物模型,观察血管内膜增生过程中TLR4/NF-κB信号传导通路的变化,以及NOD1受体在动脉损伤后增生的血管内膜中的表达和功能。比较NOD1受体在增生的内膜平滑肌细胞（iSMC）和血管中层平滑肌细胞（mSMC）中的功能。同时还对NOD1和NOD2受体在人冠状动脉VSMC中的表达及其介导的先天免疫信号传导通路在VSMC的激活过程中的作用进行研究,并探讨NOD2与TLR2、4介导的先天免疫信号传导通路在此过程中的相互关系,探讨先天免疫模式识别受体在血管内膜增生和VSMC激活过程中的作用,为防治动脉粥样硬化形成和PCI术后再狭窄提供新的思路。方法和结果:第一部分:建立大鼠颈动脉血管损伤模型,将大鼠分为正常血管组、损伤7天组和损伤14天组,用免疫组织化学染色、Western blotting和半定量反转录多聚酶联聚合反应（RT-PCR）的方法,检测了TLR4和NF-κB在损伤的大鼠颈动脉中的表达。结果发现大鼠颈动脉新生内膜在血管损伤后7天增加,增厚的内膜中以VSMC为主,损伤14天后血管内膜增生更加明显。新生的内膜平滑肌中TLR4和NF-κB染色阳性信号损伤14天组（TLR4:37.20±2.10;NF-κB:23.2±0.68）高于损伤7天组（TLR4:15.58±0.91;NF-κB:9.8±0.5）,损伤7天组要高于正常组（TLR4:1.50±0.36;NF-κB:1.0±0.3）。与此一致,增生的内膜平滑肌中TLR4蛋白和mRNA表达水平也随损伤时间增加,损伤14天组（TLR4蛋白:57.1±2.2;TLR4 mRNA:0.49±0.019）高于损伤7天组（TLR4蛋白:26.2±0.9;TLR4 mRNA:0.39±0.014）,损伤7天组要高于正常组（TLR4蛋白:12.0±0.5;TLR4 mRNA:0.18±0.013）。第二部分:我们用计算机比对分析的方法在大鼠基因组中确定了人类NOD1基因的类似物,并发现它们在保守的结构域上高度同源。我们应用大鼠颈动脉血管损伤模型,用免疫组织化学染色和半定量RT-PCR的方法,检测了大鼠NOD1在损伤血管中的表达。我们发现在大鼠NOD1 mRNA在颈动脉损伤后表达增加,通过免疫组化染色的方法确定了NOD1主要位于增生的内膜中。我们将增生的iSMC分离培养,并用NOD1受体特异的配体diaminopimalic acid（DAP）刺激iSMC,用实时定量RT-PCR法检测了iSMC中诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase ,iNOS）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达,结果发现DAP能以时间和剂量依赖的方式诱导iSMC表达iNOS。刺激NOD1还能够诱导TNF-α在iSMC中短暂的表达上调。DAP还能以时间和剂量依赖的方式诱导iSMC分泌一氧化氮（nitric oxide ,NO）。我们分别用DAP和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）单独或联合刺激iSMC和mSMC 24小时,用Western blot的方法分析NOD1、受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2,Rip2）和iNOS蛋白的表达,并检测细胞培养物上清液中NO的浓度。结果发现DAP只能诱导iSMC表达RIP2和iNOS。mSMC中没有RIP2蛋白表达。DAP和IFN-γ还能协同诱导iSMC产生NO,而在mSMC中没有发现这种协同现象。第三部分:（一）体外培养人冠状动脉VSMC,用NOD1受体的激动剂PGN（10μg/ml）刺激0、3、6和24h,用实时定量RT- PCR检测VSMC中NOD1和成纤维生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2） mRNA的表达,用ELISA法测定细胞培养物上清夜中白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）和TNF-α的浓度。发现VSMC在静息状态下表达低水平的NOD1。PGN刺激能够引起VSMC中NOD1 mRNA表达上调（从0.164±0.005增加到0.231±0.027,p<0.05）。伴随NOD1表达上调,PGN刺激能引起VSMC中FGF-2 mRNA快速、短暂的表达上调,在6h（22.72±0.58）达到高峰,随即下降（24h:8.85±0.96;3h:13.74±0.77; 0h:8.05±0.26）。PGN刺激能引起细胞培养物上清液中IL-8和TNF-α的分泌显著增加（IL-8从0.12±0.01 ng/ml增加到2.31±0.11ng/ml;TNF-α从4.22±0.50 pg/ml增加到143.11±12.58 pg/ml）。（二）体外培养人冠状动脉VSMC,用NOD2激动剂胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide,MDP）、TLR2激动剂（Pam3CSK4,PAM3）和TLR4激动剂脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）单独或联合进行刺激,用实时定量RT- PCR检测VSMC中NOD2和FGF-2 mRNA的表达,用ELISA法测定细胞培养物上清液中IL-8和TNF-α的浓度,用MTT检测VSMC增殖活性。MDP能使VSMC中NOD2 mRNA呈时间依赖性表达上调（0h:0.028±0. 001;3h:0.045±0.002;6h:0.053±0.002;24h:0.162±0.013）,并能引起VSMC中FGF-2 mRNA的表达增加（9.32±0.37 vs对照组7.44±0.25;p<0.05）,细胞培养物上清液中IL-8（2.41±0.22 ng/ml vs对照组1.02±0.13 ng/ml;p<0.05）和TNF-α（51.9±4.73 pg/ml vs对照组29.4±3.73 pg/ml;p<0.05）的分泌增多和细胞增殖活性增加（0.87±0.05 vs对照组0.72±0.02;p<0.05）。MDP还能协同LPS、PAM3诱导VSMC活性增加,细胞培养物上清液中IL-8和TNF-α的分泌增加。结论:1.在大鼠颈总动脉球囊损伤后再狭窄模型中,TLR4的mRNA及蛋白水平均表达增高,NF-κB活性增加,表明TLR4/NF-κB通路有可能参与了再狭窄形成的过程。2. NOD1在大鼠组织中也有表达并与人NOD1高度同源。NOD1在血管损伤修复过程中表达上调,并主要集中于增生的iSMC。iSMC中的NOD1激活后能强烈诱导iNOS和TNF-α这两个NF- B依赖的基因的表达,表明NOD1是一个特异的血管内膜增生先天免疫反应介质。iSMC与mSMC胞浆内的NOD1受体功能的不同,这可能是由两者下游的信号通路不同所致,在mSMC中缺乏NOD1信号传导通路中关键的下游衔接分子RIP2蛋白表达。3. VSMC中NOD1介导的先天免疫信号传导通路被激活后能引起下游的促炎症因子如IL-8和TNF-α分泌增加,诱导VSMC表达FGF-2。这可能代表一个与血管炎症和内膜形成有关的新的先天免疫反应激活通路。4. NOD2介导的先天免疫信号传导通路的激活能导致VSMC增殖活性增加,诱导其分泌促炎症细胞因子。该信号通路与TLR2、4介导的先天免疫信号传导通路在促进VSMC增殖活性增加,诱导VSMC分泌促炎症细胞因子的过程中具有协同作用。
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