两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的致病性研究

论文摘要

本试验利用2株1996年和2004年从我国广东地区分离的H5N1亚型禽流感病毒感染4周龄SPF鸭,针对H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的致病性进行了系统研究。以106EID50的病毒量鼻腔感染SPF鸭后,于第3、5、7、9 d分别剖杀感染鸭3只,采集喉头拭子、泄殖腔拭子、各组织脏器,进行病毒含量滴定、荧光定量PCR检测、病理组织学和免疫组织化学检验,探讨了H5N1亚型禽流感病毒在鸭体内各脏器的含量、分布、引起的病理变化以及排毒情况。2株禽流感病毒对鸭表现为不同的致病性:GS/GD/1/96毒株对SPF鸭的致死率为0,且无临床症状,剖检后无肉眼可见病理变化,各器官均分离不到病毒,免疫组织化学检测未发现病毒抗原信号;而DK/GDJD/23/04毒株对SPF鸭的致死率为100%,且表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,胸腺出血,脾脏肿大并有坏死灶,肺脏严重充血、出血,腺胃粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征的病理变化。各器官均可分离到病毒,脑组织病毒含量最高,免疫组织化学检测发现有病毒抗原信号。应用ELISA、细胞培养技术及CCK测定法,对4周龄SPF鸭感染H5N1 AIV后,其血清中IL-2、IFN-γ的含量,脾脏淋巴细胞对ConA刺激的T淋巴细胞增殖功能动态变化的研究发现,GS/GD/1/96毒株可促使外周血淋巴细胞分泌和释放IL-2和IFN-γ（p＜0.05）,但不能引起外周血T淋巴细胞的转化率的变化;而DK/GDJD/23/04毒株不仅可促使外周血淋巴细胞合成和释:IL-2（p＜0.05）和IFN-γ（p＜0.01）,最主要的是能引起外周血T淋巴细胞的转化率显著降低（P＜0.01）,并引起脾、胸腺及盲肠扁桃体的出血和淋巴细胞减少的变化,说明该病毒具有显著的抑制鸭细胞免疫功能的作用。进一步证实了DK/GDJD/23/04毒株感染后可引起鸭免疫功能抑制。全基因组测序分析表明,2株病毒均为高致病性毒株,在分子结构上,二者HA蛋白上的糖基化位点完全一致,二者HA蛋白的差异有2处,一是DK/GDJD/23/04裂解位点为连续的5个碱性氨基酸（-RRRKK-）,GSGD/1/96为6个连续的碱性氨基酸（-RRRKKR-）;二是在可能的受体结合位点224-229位,DK/GDJD/23/04的氨基酸为RLVPKI,而GSGD/1/96的序列为RLVPEI,即228位氨基酸E到K的变化。二者NA蛋白的差异有2处,一是DK/GDJD/23/04在NA蛋白颈部49-68位缺20个氨基酸,相应的缺失了4个潜在糖基化位点。GSGD/1/96 NA蛋白颈部没有发生缺失。二是DK/GDJD/23/04NA蛋白在386位有糖基化位点,而GSGD/1/96 NA蛋白在386位没有糖基化位点。DK/GDJD/23/04的NA蛋白颈部49-68位20个氨基酸缺失、NS1蛋白在80-84位有5个氨基酸缺失,这些缺失存在于大多数H5N1亚型人源和禽源分离株中,有利于禽流感病毒在家禽中传播,成为2002-2004年流行的优势病毒。上述这些差异可能是2株病毒对鸭致病性差异的重要原因。遗传演化分析表明,二株病毒存在差异,DK/GDJD/23/04与04年及以后的流行株亲缘关系很近,此毒株已在家禽中传播并发生了变异。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 综述部分
• 文献综述
• 1 禽流感病毒的结构及组成
• 2 禽流感病毒的复制
• 3 禽流感病病毒的抗原变异机理
• 4 禽流感病毒的致病性
• 4.1 禽流感病毒致病性的分子基础
• 4.2 禽流感病毒的宿主特异性分子基础
• 5 禽流感病毒与宿主的免疫反应
• 5.1 体液免疫
• 5.2 细胞免疫
• 6 禽流感病毒的生态学
• 6.1 水禽在禽流感病毒生态学中的地位
• 6.2 禽流感的公共卫生意义
• 7 本研究的目的和意义
• 试验部分
• 第一章 两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的感染性
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 试剂及主要仪器
• 50)的测定'>1.4 感染用毒株鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定
• 1.5 感染用毒株对鸡胚、鸭胚的致病力比较
• 1.6 SPF鸭的感染试验
• 2 结果
• 50)的测定'>2.1 感染用毒株鸡胚、鸭胚半数感染量(EID₅₀)的测定
• 2.2 感染鸭的临床症状、死亡情况、剖检变化、组织病理学变化
• 2.3 脏器及拭子中的病毒含量测定
• 2.4 病毒在鸭体内的分布
• 3 讨论
• 3.1 两株H5N1亚型禽流感病毒对鸭的致病性比较
• 3.2 DK/GDJD/23/04病毒在鸭脏器内的分布及含量
• 3.3 DK/GDJD/23/04病毒致鸭死亡的可能机制
• 第二章 两株H5N1亚型禽流感病毒感染对SPF鸭细胞免疫功能影响的初探
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 试剂及主要仪器
• 1.4 SPF鸭的感染试验
• 1.5 数据处理
• 2 结果
• 2.1 感染后第3、5、7、9 d SPF鸭血清中IL-2的变化
• 2.2 感染后第3、5、7、9 d SPF鸭血清中IFN-γ的变化
• 2.3 感染鸭脾脏T淋巴细胞增殖功能的变化
• 3 讨论
• 第三章 两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭致病性分子基础的探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株
• 1.2 SPF鸡胚
• 1.3 主要试剂与仪器
• 1.4 引物
• 1.5 病毒RNA的提取
• 1.6 cDNA合成
• 1.7 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
• 1.9 PCR产物回收和纯化
• 1.10 PCR回收产物鉴定
• 1.11 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.12 目的基因DNA产物的连接与转化
• 1.13 阳性质粒的筛选
• 1.14 粗提质粒
• 1.15 质粒DNA纯化
• 1.16 重组质粒的PCR鉴定
• 1.17 DNA测序
• 1.18 序列的拼接分析
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR结果
• 2.2 序列测定及表面蛋白进化分析结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢