(南京市第二医院江苏南京210003)
通讯作者：易永祥，男，1966年01出生，大学本科学历，副院长、肝胆外科主任医师，主要研究领域：肝胆外科的临床研究，尤其在肝癌的手术、消融术、经血管栓塞术的时机把握和在此基础上的化疗、免疫治疗等方面都有一定的研究。在美国期间，主要进行肝癌生物治疗的基础和临床
注：南京市科委国际合作项目：DRibble抗肿瘤疫苗联合抗CTLA-4抗体治疗黑色素瘤的研究项目编号：201303049
【摘要】：目的探讨DC细胞联合肿瘤特异性抗原的主动免疫治疗肝细胞肝癌患者治疗前后血清干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的表达及临床意义。方法应用ELISA方法对30例健康者和80例肝细胞肝癌患者治疗前、治疗后的1个月及3个月血清中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10含量进行检测。结果与健康对照组相比，肝癌患者血清中IFN-γ、IL-6及IL-10表达均升高（P<0.05）,治疗后仅IFN-γ升高（P<0.05）,IL-6及IL-10表达均降低（P<0.05），IL-2、IL-4治疗前后均无显著差异（P>0.05）。结论检测主动免疫治疗肝细胞性肝癌患者治疗前后血清中细胞因子的表达，对监测疾病发展、评价疗效、判断预后有一定的作用。
【关键词】：主动免疫；干扰素-γ；白介素；肝细胞性肝癌
1资料与方法
1.1一般资料
选取本院2010年1月-2013年6月住院患者80例，男54例，女26例；年龄30-82岁，平均年龄（56.5±13.4）岁，病理诊断为HCC患者。所有患者均接受过以DC细胞为载体的肝癌疫苗治疗。正常对照组30例，为本院健康体检人群。
1.2方法
人IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10试剂盒均购于江苏凯基生物科技发展有限公司，酶标仪为BIO-RAD公司的Benchmark酶标仪。
本研究选取肿瘤细胞的自噬小体作为肿瘤抗原，在抽血之日的第2天经B超引导注射至双侧腹股沟淋巴结内。从抽取的50mL外周血中经密度梯度离心法分离外周血单核细胞，后经GM-SCF、IL-4诱导DC细胞，于培养的第5天皮下注射于双侧腹股沟。肿瘤疫苗和DC细胞每隔一周注射一次，三次为一疗程。分别在一个疗程结束之后1个月、3个月清晨空腹抽取静脉血3mL，静脉血标本采集后立即离心，将获得的血清置-80℃冰箱保存待检。采用双抗体夹心ELISA法检测所有标本的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10含量，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。人IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10试剂盒均购于江苏凯基生物科技发展有限公司，酶标仪为BIO-RAD公司的Benchmark酶标仪。
1.3统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计学处理，结果均以均数±标准差表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
各组标本血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10检测结果见表1。HCC患者除血清IL-2和IL-4外，IFN-γ、IL-6及IL-10测定结果与对照组比较有显著差异（P<0.05）。经DC细胞联合自噬小体的肝癌疫苗治疗后血清IFN-γ水平均高于治疗前（P<0.05），治疗后1、3个月血清中IL-6及IL-10水平较治疗前均下降（P<0.05），治疗前后IL-2和IL-4水平均无显著差异（P>0.05），见表1。
3讨论
由于大多数肿瘤细胞缺乏免疫共刺激分子，其自身无法激活初始CD8+T细胞，因此必须依赖专职抗原提呈细胞(pAPC)通过交叉递呈的方式递呈肿瘤抗原并诱导特异性CD8+T细胞应答。但在肿瘤免疫中，由于短寿蛋白产物和有缺陷的核糖体产物（DRips）的半衰期极短，pAPC摄取、处理及递呈的抗原多肽(包括MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子限制性多肽)主要来源于肿瘤细胞的长寿蛋白。因此，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽与pAPC交叉递呈的抗原多肽所含抗原信息存在不对称性，而这种不对称性是造成现有肿瘤疫苗诱导的效应细胞难以有效识别肿瘤细胞的主要原因之一，同时也是肿瘤细胞发生免疫逃逸，使之治疗效率低的的重要原因之一。研究表明，自噬在参与肿瘤细胞MHC分子的抗原递呈中起作用。通过研究自噬与抗原交叉递呈的关系，通过诱导肿瘤细胞自噬，增强肿瘤抗原交叉递呈，制备肿瘤疫苗，从而有望激发机体有效的抗肿瘤免疫应答。通过诱导肝癌细胞发生自噬，抑制溶酶体/蛋白酶体活性，富集自噬小体，其中包含了各种类型的肿瘤细胞抗原，包括长寿蛋白、短寿蛋白和DRiPs，我们将这些富含自噬小体的囊泡称作DRibbles（DRiPs-containingblebs）。本研究选择Dribbles作为肿瘤抗原有望平衡直接递呈和交叉递呈间肿瘤抗原信息对称性，激活有效的免疫应答。
各种细胞因子的分泌异常在肿瘤的发病过程中发挥着重要的作用。黄传钟等[1]通过流式细胞微球阵列术（CBA）检测了39例原发性肝细胞癌患者的癌与非癌组织中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A细胞因子水平，结果发现Th17细胞所分泌的IL-17A，以及IL-6在肝癌组织中的表达与非癌组织比较有显著性升高，而IL-2、IL-4、IFN-γ则在非癌组织中高表达。在肿瘤的免疫应答过程中，IFN-γ、IL-2是经CD4+T细胞中的Th1型细胞和CD8+T细胞中的Tc1型细胞分泌，属于MHCⅠ类分子，可通过刺激NK细胞和CTL细胞活化，激活单核细胞、巨噬细胞和NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤途径，促进肿瘤细胞凋亡；而IL-4、IL-6、IL-10由CD4+T细胞中的Th2型细胞和CD8+T细胞中的Tc2型细胞分泌，属于MHCⅡ类分子，可通过抑制MHCⅠ分子的表达，降低抗原提呈能力，影响CTL对肿瘤抗原的识别，使肿瘤细胞逃避特异性CTL的杀伤作用。IL-10在介导免疫耐受方面具有重要作用。Th1、Th2型细胞因子水平及比例变化在机体免疫调节中具有重要意义，Th2向Th1漂移可促进抗肿瘤效应，若Th1/Th2比例向Th2偏移则会造成免疫抑制状态，干扰抗肿瘤免疫反应，有可能发生肿瘤细胞的免疫逃避。本研究发现，与健康对照组相比，HCC患者的血清IFN-γ、IL-6及IL-10表达明显升高，说明肿瘤患者体内的免疫状态处于一种应激状态，但是免疫激活和免疫抑制处于非平衡状态，因此不能发挥有效的抗肿瘤作用。经DC联合Dribbles肝癌疫苗治疗后，IFN-γ表达进一步提高，而IL-6、IL-10的表达下降，说明DC联合Dribbles肝癌疫苗能够平衡CD4+T细胞的分化方向，使Th2向Th1漂移，促进抗肿瘤效应。由于本文中检测的免疫指标有限，随访时间较短，因此需要加大标本量及检测指标进一步研究其内在关系，使之与临床关系更加确定。
综上所述，分析HCC主动免疫治疗前后的免疫相关细胞因子水平可以探查肝癌患者机体的免疫状态，为HCC的综合治疗、疗效观察、预后判断等提供了新的思路。
参考文献
[1]黄传钟、李洁羽、陈淑萍、刘枋、叶韵斌.IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A在肝癌组织中表达及其与乙肝病毒感染的关系.中国免疫学杂志.2015;31(4):527-30.