论文摘要
目的:构建大鼠血红素氧合酶Ⅰ真核表达质粒pVAX1-HO-1,注入大鼠腓肠肌,检测缺血再灌注后注射部位肌肉组织和血清中丙二醛、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和总抗氧化能力的水平。分析重组质粒对腓肠肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法:①重组质粒pVAX1-HO-1的构建:成年雄性SD大鼠,颈椎脱臼法处死,取脾脏提取总RNA,RT-PCR扩增HO-1基因,克隆到T载体,亚克隆到pVAX1真核表达载体,获得重组质粒pVAX1-HO-1,并予大量提取和纯化。②重组质粒表达初探:成年雄性SD大鼠,体重200±10g,随机分为4组,即对照组,低剂量组,中剂量组和高剂量组。对照组注射生理盐水,实验组注射重组质粒,每周1次,持续4周。颈椎脱臼法处死,RT-PCR和免疫组织化学方法测定骨骼肌组织中HO-1的表达水平。③成年雄性SD大鼠,体重200±10g,随机分为两组,即实验组和对照组。实验组腓肠肌注射重组质粒每周1次,持续4周;对照组以同样方法注射生理盐水。4周后取血清和腓肠肌组织测丙二醛、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和总抗氧化能力的水平。结果:①获得的HO-1基因测序结果与GeneBank中序列进行比对,结果显示277位G被A替换,781位G被T替换,经氨基酸序列比对发现此两处为同义突变。重组质粒经PCR和双酶切鉴定显示,重组质粒为阳性。分光光度法对提取的重组质粒进行测定,结果为OD260=1.062,OD280=0.633,OD260/280=1.678。②半定量RT-PCR和免疫组织化学方法对注射重组质粒的大鼠腓肠肌组织进行测定,电泳图谱显示HO-1基因带的亮度比较情况为低剂量组＜中剂量组＜高剂量组,说明500μg的注射剂量可获得较好的表达效果。③实验组大鼠腓肠肌和血清中MDA含量显著低于对照组（P＜0.0 1）而AOC含量显著高于对照组（P＜0.01）;血清中LDH含量显著高于对照组（P＜0.05）,CK水平无统计学意义（P＞0.05）。结论:①重组质粒的注入可使大鼠腓肠肌HO-1表达,表明HO-1真核表达载体构建成功。②重组大鼠血红素氧合酶对骨骼肌缺血再灌注损伤具有保护作用。
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