论文摘要
创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）是弧菌属第5群细菌,根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其死亡率高达50%以上。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。我国国内1990年首次报道一例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为药物超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。因此,认清创伤弧菌感染的特点及致病机制,建立适合的诊断方法至关重要。有研究表明金属蛋白酶（VVP）及溶细胞毒素（VVC）作为创伤弧菌的两种胞外产物,与创伤弧菌的致病性密切相关。虽然目前有大量关于金属蛋白酶及溶细胞毒素与创伤弧菌致病性关系的研究,例如:有学者认为金属蛋白酶具有增加血管通透性,引起出血性损伤的作用;而溶细胞毒素是创伤弧菌分泌的一种水溶性的多肽,是创伤弧菌致病性的重要因素之一。但是目前这两种胞外产物的具体致病机制及其在感染创伤弧菌机体中的定位并未明了。在对创伤弧菌感染的诊断方面,由于创伤弧菌引起的腹泻及最初的症状并无特异性,因而实验室诊断成为最可靠的确诊手段。以免疫学为基础的血清学检测,是采用单克隆或多克隆抗体,利用抗原抗体特异性反应,并结合生物化学或物理学方法而建立的免疫学检测方法。由于其操作简便、快速,结果易于判定,在创伤弧菌的鉴定中日益显出优势。而以免疫学为基础的血清学检测诊断的实施,其首要条件是选择合适的被测靶抗原,并且获得针对靶抗原的高质量特异性抗体也是其根本所在。金属蛋白酶及溶细胞毒素均是创伤弧菌的胞外产物,且与创伤弧菌的致病性密切相关。另一方面,分别表达这两种胞外产物的基因:vvp和vvhA,在不同创伤弧菌菌株之间也具有高度保守性。因此,金属蛋白酶及溶细胞毒素可以作为创伤弧菌感染诊断的实验室检测靶标。无论是研究这两种胞外产物的具体致病机制还是要制备以它们为靶标的Vv免疫检测试剂盒,都必须以获得相应的足量、高纯度的金属蛋白酶和溶细胞毒素为基础。但是金属蛋白酶和溶细胞毒素作为创伤弧菌种特征性的外毒素,它们自然分泌产量并不高,且因方法学的限制,采用常规生化方法获得足量高纯度的蛋白相当困难。而通过基因工程的方法,就可以在一个合适的系统中,使外源基因高效表达,从而生产有价值的蛋白质,对其应用或进行功能的研究。目的:通过基因工程的方法,建立使vvp及vvhA基因高效表达的原核表达系统,从而得到高产量高纯度的创伤弧菌金属蛋白酶和溶细胞毒素。并在此基础上制备分别针对二者的多克隆抗体并初步研究这两种创伤弧菌胞外产物的具体致病作用及其在感染创伤弧菌机体中的定位,为揭示Vv的致病机制、临床Vv感染的诊治及进一步免疫检测试剂的研究提供依据。方法:1.创伤弧菌溶细胞毒素vvhk基因及金属蛋白酶vvp基因的体外扩增、克隆及序列分析:（1） PCR扩增、目的片断的纯化回收及连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α:以Vv基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增vvhA、vvp基因的全长cds片断;紫外灯下切下含目的片断的凝胶,应用TakaRa的凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化;纯化回收的目的片断与T-载体在连接酶的作用下进行连接反应;CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α,将连接产物转化感受态细胞。（2）鉴定及序列分析:氨卞抗性筛选后,用质粒小提试剂盒对具有氨卞抗性的克隆进行质粒抽提;以提取的质粒为模板进行PER扩增反应,对PCR阳性结果的重组质粒再用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒分别命名为pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,并进行测序,对测序结果进行序列分析。2.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA及金属蛋白酶vvp重组表达质粒的构建及鉴定:（1）原核表达载体的构建:对重组质粒pGEM-T-vvhA、pGEM-T-vvp及质粒pET-32a+用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。切下含有目的片断的凝胶带后,进行纯化回收。vvp、vvhA基因片断分别与pET-32a+质粒酶切片断在T4连接酶的作用下连接;并将连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）。（2）重组质粒的筛选和鉴定:用质粒小提试剂盒对具有氨卞抗性的克隆进行质粒抽提;以提取的质粒为模板进行PCR鉴定和以BamH I和Xho I双酶切鉴定后,将两种重组质粒分别命名为pET-32a-vvhA和pET-32a-vvp。以诱导剂IPTG诱导外源基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达,对表达产物作SDS-PAGE分析,将融合蛋白分别命名为rVVP及rVVC,并以抗6×His组氨酸单克隆抗体为一抗对融合蛋白的表达进行免疫印迹检测。3.溶细胞毒素及金属蛋白酶重组蛋白的纯化及抗原性分析:（1）蛋白表达条件的优化:对蛋白表达可溶性进行分析后针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。对实验得出的最佳诱导条件组合进行验证。（2）目的蛋白的纯化、复性、浓缩、浓度测定及抗原性分析:以最佳诱导条件对重组工程菌进行诱导后,超声破菌。融合蛋白rVVP及rVVC经过His-Bind亲和层析方法获得纯化。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用Bradford法进行蛋白定量,绘制标准曲线计算出蛋白浓度。以纯化后的重组蛋白为抗原,以兔抗创伤弧菌全菌血清为一抗,通过间接ELISA法及Western-blot检测重组蛋白抗原性。4.溶细胞毒素及金属蛋白酶多克隆抗体的制备及溶细胞毒素及金属蛋白酶致病性的研究:（1）多克隆抗体的制备:将蛋白与佐剂1:1混合后注射新西兰大白兔,皮下多点注射。用免疫琼脂双扩散法初步检测抗体的滴度,当滴度达到1:16后,颈动脉放血,提取血清,并对免疫血清进行效价测定及特异性检测;根据抗血清特异性检测结果,对多抗血清进行吸收纯化,得到多克隆抗体。（2）溶细胞毒素及金属蛋白酶致病性的研究:昆明小鼠36只,应用随机数字表法随机分成6组,每组6只,分别为溶细胞毒素注射组、金属蛋白酶注射组、溶细胞毒素及金属蛋白酶联合注射组、Vv活菌注射组及对照1组、对照2组。Vv活菌注射组腹腔注射Vv菌液;对照1组腹腔注射等量的灭菌的Marinebroth 2216培养基;溶细胞毒素注射组及金属蛋白酶注射组小鼠分别注射前述纯化复性的rVVC及rVVP,联合注射组小鼠注射rVVC和rVVP的混合液;对照2组尾静脉注射等量的灭菌的透析液。随后对小鼠一般情况进行观察及脏器组织的Vv分离鉴定和病理学观察,以确定溶细胞毒素及金属蛋白酶对各脏器组织的致病性;以所制备的多克隆抗体为一抗免疫组化法检测组织中创伤弧菌溶细胞毒素和金属蛋白酶的分布情况。结果:1.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA基因及金属蛋白酶vvp基因的体外扩增、T-A克隆及序列分析:从VvATCC27562株DNA模板中扩增vvhA基因及vvp基因cds全长,均获得与预期大小相符合的目的条带。经过T-A克隆得到重组质粒pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,对其进行测序、序列分析及比对:vvp基因cds全长1830bp,A、T含量分别为25.96%和24.54%,（G+C）含量占49.5%。其核苷酸序列与创伤弧菌E86株的vvp基因序列（GeneBank No.DQ923325）比较,同源性为99%,有17处点突变。其中15处为同义突变;2处为错义突变:vvhA基因cds全长1356bp,A、T含量分别为27.65%和23.89%,（G+C）含量占48.45%。其核苷酸序列与创伤弧菌CDC B3547株的vvhA基因序列（GeneBank No.AB124803.1）比较,同源性为99%,有9处点突变并且均为同义突变。2.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA及金属蛋白酶vvp重组表达质粒的构建及鉴定:表达载体pET-32a-vvhA及pET-32a-vvp转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导,均能表达融合蛋白。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC及rVVP均能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异性结合,这一结果也证实所构建的两种原核表达系统均能表达融合6×His组氨酸的蛋白。3.溶细胞毒素金属蛋白酶重组蛋白的纯化及抗原性分析:基于正交实验设计优化融合蛋白的表达条件,对实验结果的直观分析及方差分析均表明:各因素对rVVP表达的重要性依次为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。本实验的最佳组合诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L:而各因素对rVVC表达的重要性依次为诱导时间、摇菌转数、诱导剂IPTG浓度、诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在各自优化的诱导条件下两种蛋白均能高效表达,蛋白表达量分别达到了40.67%（rVVP）及58.27%（rVVC）。通过亲和层析的方法可以获得较纯的蛋白,并且两种蛋白都具有良好的抗原性。4.溶细胞毒素VVC及金属蛋白酶VVP多克隆抗体的制备及其致病性研究:（1）多克隆抗体的效价及特异性检测:吸收纯化后的溶细胞毒素及金属蛋白酶多克隆抗体分别与相应的溶细胞毒素及金属蛋白酶均能很好地特异性结合,且与多种常见细菌菌体无交叉反应;两种抗体的效价均达到了1:12800。（2）腹腔注射Vv致小鼠感染后致小鼠多脏器损伤,尤以肺、肝脏、肾脏的损伤最为严重。肺和肾脏的损伤均以出血性病变为主,而肝脏的损伤表现为肝细胞广泛的水肿、气球样变性。（3）溶细胞毒素及金属蛋白酶对小鼠各脏器组织的致病性观察:溶细胞毒素可导致小鼠肺脏的损伤,且与腹腔注射Vv致小鼠感染后肺损伤相似,以出血性病变为主。而金属蛋白酶未对小鼠的各脏器组织造成明显损伤。溶细胞毒素联合金属蛋白酶作用导致的小鼠肺损伤与溶细胞毒素单独作用没有差别。（4）免疫组化检测结果:溶细胞毒素注射组、联合注射组及Vv活菌注射组小鼠肺组织中均检测到了溶细胞毒素的分布:主要分布于肺支气管上皮、肺泡上皮;以兔免疫前血清作为一抗的阴性对照组肺组织,肺支气管上皮及肺泡上皮均为阴性结果;肝脏和肾组织中未见溶细胞毒素分布。而金属蛋白酶注射组、联合注射及Vv活菌注射组小鼠的各主要脏器组织中均未检测到金属蛋白酶的分布。结论:1.证实了vvp基因及vvhA基因均在创伤弧菌的不同菌株之间具有高度的保守性。2.构建了创伤弧菌vvp基因及vvhA基因高效原核表达系统,得到了高纯度有活性的重组蛋白rVVP和rVVC;两种蛋白均具有良好的免疫原性,为创伤弧菌致病机制的研究及创伤弧菌免疫检测试剂盒及疫苗的研制奠定了基础。3.成功制备了特异性较好的抗Vv溶细胞毒素多克隆抗体及抗Vv金属蛋白酶多克隆抗体。4.首次证实创伤弧菌感染机体时,溶细胞毒素对其毒性的产生是必须的,溶细胞毒素可独立发挥作用对机体造成损伤;发现肺脏是创伤弧菌感染机体时其毒力因素溶细胞毒素作用的靶器官。5、在注射剂量为0.338mg/只的情况下,金属蛋白酶不能独立作用对小鼠机体组织造成损伤;金属蛋白酶对伤弧菌毒力的产生可能并不是必须的。6、溶细胞毒素和金属蛋白酶之间不存在相互协同或抑制作用。