拟南芥F-box基因AtPP2-B11的功能分析及苹果RING finger型泛素连接酶E3的家族分析

论文摘要

泛素/26S蛋白酶体途径是一类重要的翻译后修饰过程,它能有效地调节功能蛋白质的选择性降解,是生命过程进行精确时空调控的重要环节之一。其中,泛素连接酶E3是在底物的特异性选择降解过程中作用最为关键成员。拟南芥基因组中大约5%的基因（大约1400多个基因）编码泛素连接酶。在众多的泛素连接酶类型中,F-box型和RING finger型是家族成员最多的两大类。本文通过对F-box和RING finger型基因的功能和结构的分析,揭示了泛素连接酶E3在基因表达调控中的重要作用。结果如下:（1）本文首先分析了一个拟南芥F-box类型蛋白的功能。利用生物信息学的方法,在拟南芥1488个泛素连接酶E3中分离到了31个含有DRE元件的E3,通过RT-PCR的方法确定了它们在干旱处理下的表达量变化情况,并从中挑出了一个受干旱诱导较明显的F-box基因AtPP2-B11进行了进一步的研究。（2）qRT-PCR的实验证明,AtPP2-B11受到干旱的诱导。GUS活性实验表明,AtPP2-B11基因上游启动子区域的DRE元件对于干旱响应起到了一定作用。同时,实验证明AtPP2-B11基因还受到ABA的部分诱导,表明AtPP2-B11基因可能是通过依赖ABA和不依赖ABA两种途径参与对干旱的响应。（3）将AtPP2-B11基因转入野生型拟南芥中进行干旱处理实验,发现超表达AtPP2-B11基因明显的减弱了植株的干旱抗性。qRT-PCR检测LEA14,COR15a,RD29A等下游干旱响应基因时发现,在干旱处理时下游基因的RNA水平均降低,干旱处理后下游基因发生了不同程度的下调,表明AtPP2-B11基因可能通过影响这些下游基因从而改变了植株的抗旱性。（4）通过酵母双杂交系统,我们以AtPP2-B11蛋白为诱饵,筛选了拟南芥干旱诱导的cDNA文库,共得到约20个阳性克隆,测序后发现可以与AtPP2-B11蛋白发生相互作用的蛋白包括LEA14,HSP70等蛋白。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步分析发现,AtPP2-B11蛋白可以与LEA14蛋白发生相互作用,暗示了AtPP2-B11基因很可能作为一个负调因子,通过调节LEA14基因的活性来影响植株的干旱抗性。（5）另外,我们还利用生物信息学的方法对苹果中的RING finger型蛋白进行了数量和结构的预测及鉴定。我们发现在苹果的基因组中有688个RING finger结构域分布于634个RING型蛋白中。根据其结构特征我们将苹果中的688个RING finger结构域分为9大类:367个RING-H2,208个RING-HC,10个RING-C2,35个RING-v,1个RING-D,11个RING-S/T,2个RING-G,10个RING-mH2和44个RING-mHC。其中,前7类是在拟南芥中曾经出现过的,后2类是在苹果中首次发现的。结构分析描述了每一种RING型结构域的典型特征。同时还鉴定了RING型蛋白中除了RING结构域以外的其他结构域,为将来RING finger蛋白的功能研究奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物泛素/265 蛋白酶降解途径
• 1.1.1 泛素（Ubiquitin, Ub）
• 1.1.2 泛素降解途径中的关键酶及其功能
• 1.1.2.1 E1（泛素激活酶）
• 1.1.2.2 E2（泛素结合酶）
• 1.1.2.3 E3（泛素连接酶）
• 1.1.2.4 去泛素化酶
• 1.1.2.5 26S 蛋白酶体
• 1.2 植物中F-box 蛋白的研究进展
• 1.2.1 F-box 蛋白的发现
• 1.2.2 F-box 蛋白的结构和分类
• 1.2.3 植物F-box 蛋白的功能
• 1.2.3.1 泛素/265 蛋白酶体与激素应答
• 1.2.3.2 在植物生长发育过程中的作用
• 1.2.3.3 在不同外界环境刺激和胁迫中的作用
• 1.3 RING finger 型E3 在植物中的研究进展
• 1.3.1 RING finger 的结构
• 1.3.2 RING finger 型蛋白的研究进展
• 1.4 植物抗旱分子机理研究概况
• 1.4.1 干旱胁迫诱导蛋白的表达与植物的抗旱性
• 1.4.2 植物对干旱胁迫信号的感应和传导
• 1.4.3 干旱胁迫应答基因
• 1.4.3.1 功能性相关基因
• 1.4.3.2 调控相关基因
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 载体与菌株
• 2.1.4 其它材料
• 2.1.5 实验引物
• 2.1.6 软件和网络资源
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 的提取
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.1.3 CTAB 法提取植物总RNA
• 2.2.2 RNA 的纯化
• 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 双链cDNA的合成
• 2.2.5 双链文库DNA 的纯化
• 2.2.6 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 2.2.8 大肠杆菌细胞的转化
• 2.2.9 质粒DNA 的提取
• 2.2.10 凝胶电泳中DNA片段的回收
• 2.2.11 序列测定
• 2.2.12 AtPP2-811及LEA14基因cDNA全长的获得
• 2.2.13 半定量RT-PCR
• 2.2.14 实时荧光定量PCR 分析
• 2.2.15 GUS 活性测定
• 2.2.16 植物转化
• 2.2.16.1 植物超表达载体的构建
• 2.2.16.2 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.16.3 农杆菌的培养
• 2.2.16.4 农杆菌介导的拟南芥转化
• 2.2.16.5 转基因拟南芥的鉴定
• 2.2.17 酵母双杂交
• 2.2.18 双分子荧光互补实验表达载体构建
• 2.2.19 本生烟草叶片瞬时转化
• 2.2.20 Clustal 的使用
• 2.2.21 Phylip 系统发育树
• 2.2.22 Mega4.1 构建系统发生树的方法
• 2.2.23 本地BLAST 方法
• 2.2.24 苹果中RING finger 蛋白的鉴定
• 2.2.25 序列比对及进化树分析
• 2.2.26 RING finger 蛋白中其他结构域的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 F-box蛋白的鉴定与功能分析
• 3.1.1 拟南芥中1488 个E3 的生物信息学分析
• 3.1.2 31 个E3 基因的干旱诱导表达分析
• 3.1.3 AtPP2-811 上游的DRE 元件在干旱诱导中的作用
• 3.1.4 超表达AtPP2-811 减弱了拟南芥的干旱抗性
• 3.1.5 干旱响应基因在WT 和超表达株系中的表达
• 3.1.6 酵母双杂交筛选AtPP2-811 的互作蛋白
• 3.1.7 AtPP2-811 与LEA14 的相互作用
• 3.2 RING finger 蛋白的生物信息学分析
• 3.2.1 苹果中RING finger 型结构域的鉴定
• 3.2.2 苹果中RING finger 型蛋白的结构特征
• 3.2.3 RING finger 结构中其他的保守氨基酸位点
• 3.2.4 苹果RING 结构域中各配体间的氨基酸数目
• 3.2.5 RING 结构域的进化分析及RING finger 蛋白中的其他结构域
• 3.2.6 RING finger 基因的染色体定位
• 3.2.7 RING finger 蛋白与苹果果实发育
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文及成果