基于热休克蛋白的慢性乙型肝炎治疗性疫苗的研究

论文摘要

乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题,全球约20亿人感染了HBV,3-4亿人为HBV慢性感染,其中25%-40%最终将死于肝硬化和肝癌。我国慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染者估计达1.3亿,其中3000多万是需要抗病毒治疗的慢性活动型乙肝患者,每年治疗费用约300-500亿元人民币。慢性乙型肝炎的治疗没有取得突破性进展,目前仍然以抗病毒治疗作为主要手段。随着分子生物医学的发展,治疗性疫苗从理论发展到应用,成为慢性乙肝治疗的新方向。本课题的目的就是开发一种基于热休克蛋白的针对慢性乙型肝炎的治疗性疫苗。 近年来发现,热休克蛋白—多肽复合物可通过受体（CD91）介导的内吞作用被巨噬细胞吞噬,然后经过蛋白酶体降解,最终进入内源性抗原呈递途径,从而激活细胞免疫。我们选择结核分支杆菌热休克蛋白65（heat shock protein 65,HSP65）与乙型肝炎病毒核心抗原（Hepatitis B virus core antigen,HBcAg）融合来作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗。HSP65可以把HBcAg蛋白呈递给MHC-I抗原呈递途径,进而激活细胞免疫。 研究表明HBcAg在HBV自限性感染中是一个免疫优势抗原,可以在小鼠模型中诱发强烈的HBcAg特异性的Th细胞反应,产生相应抗体及HBcAg的T细胞表位激发特异性的CTL反应。我们选用HBcAg作为靶抗原,将其融合在HSP65的C端,以激发针对HBV的特异性的细胞免疫。 我们在大肠杆菌中获得了HSPHBcAg基因的可溶性高表达。为了便于纯化,在C末端融合了极性结构域Z-tag。HSPHBcAgZtag蛋白经硫酸铵沉淀、阳离子交换层析和凝胶过滤层析后获得了纯度超过80%的样品。经纯化的融合蛋白作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗。应用此融合蛋白免疫小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,检测细胞在ConA、HBcAg下的T细胞增殖反应,结果表明融合蛋白组的T细胞增殖明显,而且对HBcAg存在记忆反应。以经过免疫的小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞,与HBcAg共孵育的小鼠细胞系P815作靶细胞,进行杀伤性实验,结果证明融合蛋白组比HBcAg组的杀伤率高。这些结果为以后治疗性乙肝疫苗的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 乙型肝炎
• 1.1.1 乙型肝炎的流行
• 1.1.2 乙型肝炎与肝硬化、肝癌的关系
• 1.1.3 慢性乙型肝炎的抗病毒治疗
• 1.1.4 慢性乙型肝炎治疗性疫苗的发展
• 1.2.乙肝核心抗原
• 1.3 热休克蛋白
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 限制性内切酶及工具酶
• 2.1.4 DNA及质粒回收试剂盒
• 2.1.5 ELISA试剂盒
• 2.1.6 细胞及实验动物
• 2.1.7 核酸及蛋白分子量标准
• 2.1.8 所有合成的引物
• 2.1.9 主要仪器
• 2.1.10 主要试剂
• 2.1.11 其他耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 主要溶液
• 第三章 实验步骤
• 3.1 目的基因的克隆
• 3.1.1 HBcAg基因设计与克隆
• 3.1.2 目的基因突变的纠正
• 3.1.3 没有终止密码子的HBcAg蛋白基因的克隆
• 3.2 表达载体的构建
• 3.2.1 带有终止密码子的HBcAg基因表达载体pET28a-HBcAg的构建
• 3.2.2 HSPE7Ztag基因表达载体pET28a-HSPE7Ztag的构建
• 3.2.3 HSPHBcAgZtag基因表达载体pET28a-HSPHBcAgZtag的构建
• 3.2.4 HBcAg-His6基因表达载体PET28a-HBcAg-His6的构建
• 3.3 表达载体转化表达菌株及目的基因的诱导表达
• 3.3.1 表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
• 3.3.2 目的基因的诱导表达
• 3.3.3 目的蛋白表达鉴定
• 3.4 工程菌5L生物反应器培养
• 3.5 目的蛋白的纯化
• 3.5.1 HSPHBcAgZtag的纯化
• 3.5.2 HBcAg-His6的纯化
• 3.5.3 蛋白样品HSPHBcAgZtag和HBcAg-His6的Western免疫印迹
• 3.5.4 蛋白的N端氨基酸测序
• 3.5.5 用Lowry法测定样品蛋白浓度
• 3.6 HSPHBcAgZtag的活性评价
• 3.6.1 小鼠体内免疫
• 3.6.2 小鼠抗-HBc血清抗体滴度的测定
• 3.6.3 P815细胞的培养
• 3.6.4 T细胞增殖试验
• 3.6.5 杀伤性T细胞试验
• 第四章 实验结果
• 4.1 基因的克隆
• 4.1.1 带有终止密码子的HBcAg基因的克隆
• 4.1.2 突变的纠正
• 4.1.3 没有终止密码子的HBcAg’基因的克隆
• 4.1.4 HSPE7Ztag基因的克隆
• 4.1.5 HBcAg-His6基因的克隆
• 4.2 各种表达载体的构建
• 4.2.1 HBcAg基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析
• 4.2.2 HSPE7Ztag基因表达载体pET28a-HSPE7Ztag的构建与酶切鉴定及序列分析
• 4.2.3 HSPHBcAgZtag基因表达载体pET28a-HSPHBcAgZtag的构建与酶切鉴定及序列分析
• 4.2.4 HBcAg-His基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析
• 4.3 表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
• 4.3.1 pET28a-HBcAg表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
• 4.3.2 pET28a-HSPHBcAgZtag表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
• 4.3.3 pET28a-HBcAgHis表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
• 4.3.4 目的蛋白表达鉴定
• 4.4 工程菌5L生物反应器培养
• 4.5 目的蛋白的纯化
• 4.5.1 目的蛋白表达方式的确定
• 4.5.2 HSPHBcAgZtag蛋白的饱和硫酸铵沉淀纯化
• 4.5.3 HSPHBcAgZtag蛋白样品S柱阳离子交换层析纯化
• 4.5.4 HSPHBcAgZtag蛋白的纯化
• 4.5.5 HBcAg-His6蛋白的纯化
• 4.5.6 HSPHBcAgZtag蛋白和HBcAg-His6蛋白的Western blot结果：
• 4.5.7 蛋白的N端氨基酸测序
• 4.6 HSPHBcAgZtag的活性评价
• 4.6.1 小鼠HBcAg抗血清抗体滴度的测定
• 4.6.2 T细胞增殖试验
• 4.6.3 记忆性T细胞检测
• 4.6.4 杀伤性T细胞试验
• 第五章 讨论
• 1.关于热休克蛋白保守性及生物学功能的探讨
• 2.HBcAg作为治疗性疫苗靶抗原
• 3.通过PCR方法获得目的基因
• 4.聚合体目的蛋白的分离纯化
• 5.慢性乙肝治疗性疫苗的动物评价实验
• 结论
• 参考文献
• 附录一 缩略词表
• 附录二 发表论文
• 致谢