论文摘要
氧在能量代谢和机体内环境稳定以及一系列生命活动中起着重要的调节作用。氧浓度的改变,作为一种重要的生理或病理性的调节因素,影响着从胚胎发生发育到机体正常功能的维持以及功能紊乱,疾病,衰老整个生命过程。大气中氧浓度为21%,而在组织水平,氧浓度显著地低于环境中大气氧浓度,动脉血中氧浓度为12%,成年组织中平均的氧浓度大约为3%,成熟骨骼肌细胞中的氧浓度大约在110%。哺乳动物骨骼肌中存在着少量的肌肉干细胞,肌肉干细胞可激活、增殖形成单核的成肌细胞,并融合分化为多核肌管。从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外培养时被统称为成肌细胞。成肌细胞在出生后骨骼肌的损伤修复和维持中发挥着重要的作用。而生理性的低氧条件才是成肌发生过程中的最适条件,目前关于低氧对成肌细胞增殖和分化的影响的研究报道甚少。本研究选取C2C12细胞作为实验对象,观察生理性低氧（3% O2）对成肌细胞体外分化的影响,并探讨低氧调控成肌细胞分化过程中可能参与的信号机制。我们首先进行了免疫荧光和免疫细胞化学实验,从表型的水平观察了C2C12细胞分别在常氧和低氧（3% O2）条件下的分化情况。结果表明,与常氧条件下相比,低氧条件下诱导分化的C2C12细胞几乎很少融合形成肌管并表达成肌终末分化的标志蛋白MHC。Western Blot分析也进一步证实了这一结果。利用RT-PCR和Western Blot分析检测了C2C12细胞中MRFs的表达变化,结果显示,低氧下调了MRFs在mRNA和蛋白水平的表达。以上结果提示,低氧（3% O2）抑制了成肌细胞的体外分化。在明确了低氧抑制成肌细胞体外分化这一现象后,我们进一步探讨了低氧抑制成肌细胞体外分化过程中可能参与的信号机制。低氧条件下HIF-1α的稳定和激活是细胞对低氧诱导反应的一个主要的特点。为了研究HIF-1α是否参与了低氧对成肌细胞体外分化的抑制作用,我们利用RT-PCR和Western Blot分析检测了低氧条件下诱导分化的C2C12细胞中HIF-1α在蛋白水平和转录水平的表达,结果表明,C2C12细胞中的HIF-1α蛋白在常氧条件下稳定,没有发生降解,HIF-1α在蛋白水平和转录水平几乎不受低氧环境的影响。同时检测了HIF-1α在诱导分化的C2C12细胞中的定位,发现低氧没有影响HIF-1α蛋白在细胞中的分布。以上结果表明,低氧抑制成肌细胞的体外分化可能是不依赖于HIF-1信号通路的。在研究过程中,我们发现在低氧抑制成肌细胞体外分化过程中Smad3蛋白的表达水平降低,然而,在C2C12细胞中过表达外源性的Smad3没有能够逆转低氧对成肌细胞分化的抑制作用。结果提示,Smad3蛋白在低氧抑制成肌细胞分化过程中不起关键的作用,Smad3蛋白水平的降低可能是低氧抑制成肌细胞体外分化过程中的一个伴随事件。随后我们研究低氧抑制成肌细胞体外分化过程中Smad3蛋白水平降低的原因时发现,Smad3的活性形式磷酸化Smad3蛋白的表达水平在低氧抑制成肌细胞体外分化的过程中下调,与Smad3蛋白水平的降低趋势相平行。有文献报道,磷酸化Smad3蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解,于是我们使用了26S蛋白酶体的抑制剂MG-132,发现在C2C12细胞的分化培养液中加入MG-132后,引起了低氧条件下磷酸化Smad3蛋白的积累。以上结果提示,在低氧抑制成肌细胞体外分化的过程中,低氧加速了磷酸化Smad3蛋白的泛素-蛋白酶体途径的降解。ERK1/2 MAPK信号通路在成肌分化过程中扮演着一定的角色。我们研究发现在诱导C2C12细胞分化过程中ERK1/2磷酸化激活,而在低氧抑制成肌细胞体外分化过程中ERK1/2的激活受到抑制。那么,是否ERK1/2 MAPK信号通路参与了低氧抑制成肌细胞体外分化的调控呢?我们瞬时转染激活型的MEK1（E）表达质粒,在C2C12细胞中过表达ERK1/2的上游激酶MEK1从而磷酸化激活ERK1/2,发现在低氧条件下,过表达激活型的MEK1（E）能够部分地逆转低氧对C2C12细胞分化的抑制作用。同时,利用免疫荧光实验检测了瞬时转染激活型MEK1（E）后,C2C12细胞在低氧条件下的分化情况。结果显示,在低氧（3% O2）条件下,表达MHC蛋白的阳性细胞的数目与转染空载体组相比有所增加。以上结果提示,ERK1/2 MAPK信号通路可能参与了低氧抑制成肌细胞体外分化的调控。综合本研究的结果,结合本实验室前期的研究工作（3% O2促进成肌细胞的增殖）我们发现了一个新的低氧调控肌肉发育的效应:3% O2浓度的生理性低氧环境促进成肌细胞的增殖,同时抑制成肌细胞的分化。在研究低氧抑制成肌细胞体外分化的机制时,发现了可能存在与通常低氧诱导的效应通路不同的机制,ERK1/2 MAPK信号通路可能参与了低氧抑制成肌细胞体外分化的过程。