玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆表达及致病性分析

论文摘要

玉米纹枯病是世界上玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一,并且已成为我国玉米产区的主要病害,其主要病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）,在活体上可以产生多种胞壁降解酶,以多聚半乳糖醛酸酶（PG）、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和纤维素酶为主。果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分,与纤维素、半纤维素一起构成一个阻挡外界的坚韧屏障,在植物细胞组织中起着“黏合”作用。果胶酶是植物病原物最重要的致病因子之一,是植物病原物破坏植物细胞壁的主要细胞壁降解酶之一。本研究以立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）AG1-IA为研究对象,根据真菌内切多聚半乳糖醛酸酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR、快速扩增cDNA末端（RACE）及TAIL-PCR的方法克隆了三种内切多聚半乳糖醛酸酶基因。其中pg1全长cDNA为1086bp,包含一个由344个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为HQ413152。pg2 DNA全长1414bp,包含六个内含子区域,登录号为HQ156225;全长cDNA为1086bp,共编码344个氨基酸,登录号为HQ156226。pg3 DNA全长1195bp,包含五个内含子区域,登录号为HQ413151;cDNA全长为927bp,包含一个由309个氨基酸组成的开放阅读框,登录号为HQ413150。序列比对分析表明,三个蛋白均属于糖苷水解酶28家族。构建了毕赤酵母重组表达载体pPIC9K/pg1、pPIC9K/pg2和pPIC9K/pg3。将重组表达质粒pPIC9K/pg1和pPIC9K/pg3转化毕赤酵母GS115,获得了转酵母工程菌株GS-PG1-4和GS-PG3-18并进行纯化,纯化后的酶液接种玉米叶片,24h后出现水浸状病斑,72h之后变为枯斑,接失活酶液的对照叶片无症状,这表明立枯丝核菌（R. solani Kühn）AG1-IA多聚半乳糖醛酸酶基因pg1和pg3中可能是玉米纹枯病的致病基因。将立枯丝核菌（R. solani Kühn）AG1-IA接种到玉米叶片上,24h产生暗绿色水渍状病斑,之后病斑中央灰褐色,边缘变为深褐色。用三条基因的三对特异引物分别进行扩增,结果1-7天都出现目的条带,说明内切多聚半乳糖醛酸酶基因参与玉米纹枯病的致病过程。立枯丝核菌（R. solani Kühn）AG1-IA分别在以果胶和葡萄糖为底物的培养基上生长,结果发现内切多聚半乳糖醛酸酶三条基因在果胶培养基上培养的菌丝中1-7天都表达,在葡萄糖培养基生长的菌丝中不表达,说明内切多聚半乳糖醛酸酶具有强烈的底物特异性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 玉米纹枯病研究进展
• 1.1.1 玉米纹枯病发生现状
• 1.1.2 玉米纹枯病症状
• 1.1.3 玉米纹枯病病原菌
• 1.1.4 玉米纹枯病侵染源及侵染途径
• 1.1.5 玉米纹枯病致病因子
• 1.1.6 玉米纹枯病防治措施
• 1.1.6.1 农业防治
• 1.1.6.2 化学防治
• 1.1.6.3 生物防治
• 1.2 立枯丝核菌致病基因研究进展
• 1.3 果胶酶研究进展
• 1.3.1 果胶酶研究现状
• 1.3.2 果胶酶分类
• 1.3.3 果胶酶基因克隆
• 1.3.4 果胶酶表达调控
• 1.3.5 果胶酶活性测定
• 1.3.6 果胶酶分离纯化
• 1.3.7 真菌果胶酶与致病性的关系
• 1.4 植物病原侵染与防御酶研究进展
• 1.5 植物病原基因敲除功能研究
• 1.6 真核表达系统概述
• 1.7 选题的目的意义、研究内容和技术路线
• 1.7.1 目的意义
• 1.7.2 研究内容
• 1.7.3 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试菌株
• 2.1.1.2 菌株与质粒
• 2.1.1.3 主要生化和分子生物学试剂、酶
• 2.1.1.4 仪器
• 2.1.1.5 培养基
• 2.1.1.6 贮存液配制
• 2.1.1.7 溶液配制
• 2.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶cDNA 克隆
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 总RNA 的提取（Trizol 法）
• 2.2.3 紫外检测RNA 产率和纯度
• 2.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.5 目的基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 2.2.5.1 目的基因cDNA 3’末端的扩增
• 2.2.5.2 PCR 产物回收
• 2.2.5.3 载体连接
• 2.2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.5.4.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.5.4.2 大肠杆菌感受态的转化
• 2.2.5.5 序列测定
• 2.2.6 Rhizoctonia solani AG1-IA 菌丝体DNA 的抽提
• 2.2.7 目的基因DNA 5’端序列的TAIL-PCR 扩增
• 2.2.8 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶基因DNA 与全长cDNA 序列的克隆
• 2.2.9 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶基因全长序列的生物信息学分析
• 2.3 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因的表达分析
• 2.3.1 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在玉米中的表达分析
• 2.3.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在不同底物中的表达分析
• 2.4 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中的表达
• 2.4.1 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶成熟肽基因序列的分离
• 2.4.1.1 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶成熟肽序列的限制性酶切位点分析
• 2.4.1.2 引物设计
• 2.4.2 质粒提取
• 2.4.3 质粒DNA 的双酶切鉴定
• 2.4.4 序列测定
• 2.4.5 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在毕赤酵母中的表达
• 2.4.5.1 酵母表达载体的构建
• 2.4.5.2 线性化质粒DNA 制备
• 2.4.5.2.1 线性化酶切
• 2.4.5.2.2 线状质粒DNA 的纯化
• 2.4.5.3 酵母转化
• 2.4.5.3.1 Pichia pastoris G5115 感受态细胞的制备（电击法）
• 2.4.5.3.2 重组表达质粒电击转化感受态酵母G5115 细胞
• 2.4.5.4 酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选
• 2.4.5.5 酵母转化子的PCR 鉴定
• 2.4.5.5.1 pPIC9K AOX1 通用引物鉴定
• 2.4.5.5.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因的特异性引物鉴定
• 2.4.5.6 外源基因多拷贝整合转化子筛选
• 2.4.5.7 酵母工程菌的培养和内切多聚半乳糖醛酸酶的诱导分泌表达
• 2.4.5.8 表达产物的生物学活性检测
• 2.4.5.9 表达产物内切多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE 分析
• 2.4.5.10 蛋白质含量测定
• 2.4.5.10.1 标准曲线的绘制
• 2.4.5.10.2 样品蛋白质浓度的测定
• 2.4.5.11 内切多聚半乳糖醛酸酶工程菌产酶曲线的测定
• 2.5 表达产物内切多聚半乳糖醛酸酶的纯化
• 2.6 重组蛋白对玉米致病性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Rhizoctonia solani AG1-IA 总RNA 的提取
• 3.2 Rhizoctonia solani AG1-IA pg cDNA 基因的分离
• 3.2.1 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因3’-末端的分离
• 3.2.2 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因5’-末端的分离
• 3.2.3 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因ORF cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接
• 3.3 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因组DNA 的扩增
• 3.3.1 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因组DNA 的提取
• 3.3.2 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因组DNA 的扩增
• 3.4 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 3.4.1 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因的核苷酸序列分析
• 3.4.2 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因的氨基酸序列分析
• 3.5 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因的表达分析
• 3.5.1 Rhizoctonia solani i AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在玉米中的表达分析
• 3.5.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在不同底物中的表达分析
• 3.6 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 成熟肽基因序列的分离
• 3.6.1 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 成熟肽序列的限制性酶切位点分析结果
• 3.6.2 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 编码序列的分离
• 3.7 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在毕赤酵母中的表达
• 3.7.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 3.7.2 表达质粒转化Pichia pastoris G5115 及酵母转化子的筛选
• 3.7.2.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选
• 3.7.2.2 酵母转化子的PCR 鉴定
• 3.7.2.3 Rhizoctonia solani AG1-IA pg 基因酵母多拷贝整合子的筛选
• 3.7.3 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物检测
• 3.7.3.1 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶pg 基因在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选
• 3.7.3.2 Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶酵母工程菌产酶曲线的测定
• 3.7.3.3 表达产物内切多聚半乳糖醛酸酶PG1 和PG3 的纯化
• 3.7.3.4 重组蛋白接种玉米叶片的致病性分析
• 4 讨论
• 4.1 立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG1-IA 内切多聚半乳糖醛酸酶的基因克隆
• 4.2 内切多聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达
• 4.3 内切多聚半乳糖醛酸酶基因对玉米的致病作用及玉米的防卫反应
• 5 结论和建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评