RNA干扰人肺癌HIF-1α基因对裸鼠移植瘤生长及放射敏感性影响的研究

论文摘要

目的构建HIF-1αRNA干扰慢病毒载体,筛选HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株,建立A549细胞和A549/HIF-1α（-）细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤细胞的成瘤性,荷瘤裸鼠生存情况,肿瘤生长曲线,瘤组织形态学表现,HIF-1α蛋白表达、血管形成及肿瘤细胞的凋亡。给予不同剂量X射线照射,观察放射治疗对裸鼠人肺癌移植瘤的治疗作用及HIF-1α基因沉默对肿瘤放射敏感性的影响。方法（1）采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAi ExpressionSystem,构建HIF-1αRNA干扰慢病毒载体,慢病毒转染A549细胞,Blascidine筛选HIF-1α基因稳定沉默的细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达。（2）分别将2×106个A549细胞和A549/HIF-1α（-）细胞注射至BALB/c裸鼠右下肢根部外侧皮下,观察肿瘤的生长情况,HE染色观察肿瘤组织,免疫组化法检测瘤组织HIF-1α的表达和微血管密度,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。（3）采用A549细胞株和A549/HIF-1α（-）细胞株建立人肺癌移植瘤模型,分别给予5Gy、10Gy、15Gy、20Gy单次剂量X射线照射,观察放射治疗对肿瘤的抑制作用,根据肿瘤生长延缓和照射剂量分析肿瘤剂量效应及HIF-1α基因沉默对在体肿瘤放射敏感性的影响。结果（1）成功构建HIP-1αRNAi慢病毒载体（lenti6-HIF1α）,其转导A549细胞的功能滴度为:1.2×106TU/ml。建立了HIF-1α基因沉默的A549/HIF-1α（-）细胞株,A549/HIF-1α（-）细胞在常氧和乏氧条件HIF-1αmRNA水平约下降85.2%和87.3%,A549/HIF-1α（-）的HIF-1α蛋白质水平在常氧和乏氧条件下分别下降97.2%和88.4%。（2）A549/HIF-1α（-）组移植瘤体积明显小于A549组,病理显示皮下移植瘤形态上保留了人肺癌细胞外形、排列方式、分化程度等特征。HIF-1α免疫组化结果显示A549/HIF-1α（-）组肿瘤细胞HIF-1α蛋白表达显著下降。MVD免疫组化结果显示A549组肿瘤血管密度为19.83±4.09/0.155mm2,而A549/HIF-1α（-）组为11.61±3.04/0.155 mm2,TUNEL结果示A549组凋亡指数（AI）为2.78±0.26,A549/HIF-1α（-）组凋亡指数为2.65±0.23。（3）放射治疗能明显抑制肿瘤生长,并观察到随照射剂量的增加肿瘤生长延缓时间延长,接受等剂量照射HIF-1α基因沉默的肿瘤生长延缓时间增加,根据肿瘤剂量效应曲线计算增敏比（SER）分别为1.40、1.34、1.31。结论成功建立HIF-1α基因沉默的A549/HIF-1α（-）细胞,常氧和乏氧状态下A549/HIF-1α（-）细胞株HIF-1α基因mRNA水平显著抑制,HIF-1α蛋白积聚被特异性阻断;A549细胞株和A549/HIF-1α（-）细胞株在裸鼠皮下具有良好的成瘤性,A549/HIF-1α（-）组裸鼠肿瘤较A549组生长缓慢,HIF-1α蛋白表达水平明显减弱,血管生成显著减少,肿瘤细胞凋亡无显著差异;放射治疗能显著抑制A549和A549/HIF-1α（-）肿瘤生长,A549/HIF-1α（-）肿瘤对放射治疗更敏感。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、慢病毒介导的RNA干扰A549肺癌细胞HIF-1α基因表达
• 1.1 对象与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、裸鼠人肺腺癌移植瘤模型的建立及瘤内HIF-1α表达的检测
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、HIF-1α表达沉默对裸鼠人肺腺癌移植瘤放射敏感性的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• HIF及RNA干扰技术在肿瘤研究的应用进展
• 综述参考文献
• 致谢