喜树异碱抗肿瘤和银屑病的活性及机制研究

论文摘要

目的：喜树碱类药物是目前临床上广泛应用的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，开发研究低毒有效的此类药物是近年来研究的热点。研究表明喜树碱类药物具有抑制肿瘤细胞、血管内皮细胞及角质形成细胞增殖并诱导其分化、凋亡的作用。本论文以舌鳞癌Tca8113细胞、人宫颈癌Hele细胞、人脐静脉血管内皮ECV304细胞及人永生化HaCaT细胞为对象，研究了本课题组最新分离发现的一种新的喜树碱类化合物—喜树异碱对上述细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用，并与喜树碱进行了活性比较。同时观察了两种药物对上述细胞端粒酶活性的影响，以探讨其抗肿瘤及抗银屑病的作用及可能机理，为该药治疗肿瘤和银屑病奠定实验基础。在此基础上，观察了寻常型银屑病患者外周血单个核细胞的端粒酶活性及与疾病严重程度的相关性，以探讨端粒酶活性检测在银屑病发病中的作用。同时，构建了端粒酶hTERT基因的反义表达质粒，经脂质体介导转染人舌鳞癌Tca8113细胞，检测转染前后端粒酶活性的改变及其对细胞生长增殖的影响，初步探索了肿瘤和银屑病基因治疗的靶点。 方法：将不同浓度的喜树异碱和喜树碱分别作用于体外培养的Tca8113、Hele、HaCaT和ECV304细胞，用MTT法检测两种药物对上述细胞增殖的抑制作用及有效浓度范围；倒置显微镜和透射电镜观察细胞处理后的形态学变化；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡；端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附（TRAP-ELISA）法检测细胞的端粒酶活性。密度梯度离心法分离19名寻常型银屑病患者和13名正常人的外周血单个核细胞，TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性，并分析其与银屑病疾病严重程度和病程的相关性。提取HeLa细胞的总RNA，经逆转录合成cDNA。经PCR扩增和酶切，获得hTERT基因的反义表达质粒。将正确的重组质粒由脂质体介导转染Tca8113细胞。经PCR及Southern杂交检测外源基因的整合。稳定转染的细胞以DNA测序法分析端粒酶活性并制作细胞生长曲线观察细胞的生长增殖情况。 结果和结论：喜树异碱和喜树碱均可以浓度依赖的方式抑制肿瘤细胞，血管内皮细胞，角质形成细胞增殖、诱导凋亡。两种药物对上述细胞的端粒酶活性均有抑制作用，且浓度低于诱导凋亡的浓度。提示端粒酶活性下调可能先于细胞凋亡而发生，证明喜树异碱和喜树碱抗肿瘤和抗银屑病的作用机制一方面可能与抑制端粒酶活性从而抑制肿瘤细胞和角质形成细胞增殖、诱导凋亡有关，另一方面可能以同样的作用抑制血管生成而达到治疗肿瘤和银屑病的目的。银屑病患者外周血单个核细胞端粒酶活性较正常人显著增高，可能与淋巴细胞的增殖活化有关，端粒酶活性水平与疾病严重程度成正相关，可作为银屑病活动和病情严重程度的一个敏感指标。本研究利用体外基因克隆技术构

论文目录

• 独创性说明
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 CPT类药物的作用机制、衍生物的开发及在皮肤肿瘤和银屑病中的应用
• 1.1.1 CPT类药物的作用机制
• 1.1.2 CPT类药物的开发及应用
• 1.1.3 CPT类药物与皮肤肿瘤和银屑病
• 1.2 管新生的机制及在皮肤肿瘤和银屑病中的作用
• 1.2.1 血管新生的机制
• 1.2.2 血管新生在皮肤肿瘤和银屑病中的作用
• 1.3 银屑病发病机制与端粒酶表达
• 1.3.1 银屑病发病中T细胞活化与端粒酶表达
• 1.3.2 银屑病发病中角质形成细胞的增殖和凋亡与端粒酶表达
• 1.4 以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗
• 1.4.1 基因转移
• 1.4.2 基因治疗策略
• 1.4.3 以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗
• 1.5 参考文献
• 2 试验用材料和方法
• 2.1 主要试剂和仪器
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 药物
• 2.1.3 主要试剂及仪器
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要实验设备和仪器
• 2.2 细胞培养和药物浓度的配制
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 药物浓度的配制
• 2.3 MTT法检测细胞的增殖抑制
• 2.4 光镜和电镜观察细胞形态和凋亡细胞
• 2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.6 琼脂糖凝胶电泳法观察细胞凋亡特征DNA Ladder带
• 2.7 端粒酶活性检测
• 2.7.1 细胞处理
• 2.7.2 单一核细胞分离
• 2.7.3 端粒酶活性测定
• 2.8 hTERT基因的制备和整合
• 2.8.1 hTERT基因的分离
• 2.8.2 hTERT基因反义表达质粒的构建
• 2.8.3 细胞培养
• 2.8.4 反义表达质粒pLNCX-TERT转入Tca8113细胞
• 2.8.5 PCR和Southern blot分析外源基因整合
• 2.9 hTERT基因整合后对细胞的影响
• 2.9.1 DNA测序法检测端粒酶活性
• 2.9.2 细胞生长速度及倍增时间的测定
• 2.10 统计学处理
• 3 Iso-CPT和CPT抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和对端粒酶活性的影响
• 3.1 前言
• 3.2 Iso-CPT和CPT对Tca8113和Hela细胞的增殖抑制作用及有效浓度
• 3.3 光镜和电镜观察细胞形态和凋亡细胞
• 3.3.1 倒置显微镜观察
• 3.3.2 电子显微镜观察
• 3.4 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡
• 3.5 凝胶电泳法观察细胞凋亡特征DNA梯状带
• 3.6 Iso-CPT和CPT对Tca8113细胞端粒酶活性的影响
• 3.7 Iso-CPT和CPT对Tca8113抑制作用的比较
• 3.8 讨论
• 4 Iso-CPT和CPT抑制角质形成细胞增殖、诱导凋亡和对端粒酶活性的影响
• 4.1 前言
• 4.2 Iso-CPT和CPT对HaCaT细胞的增殖抑制作用及有效浓度
• 4.3 光镜下细胞形态变化
• 4.4 电镜下细胞形态
• 4.5 流式细胞仪检测细胞周期的变化及细胞凋亡
• 4.6 Iso-CPT和CPT对HaCaT细胞端粒酶活性的影响
• 4.7 Iso-CPT和CPT对HaCaT细胞增殖抑制作用的比较
• 4.8 讨论
• 5 Iso-CPT和CPT抑制血管内皮细胞增殖、诱导凋亡和对端粒酶活性的影响
• 5.1 前言
• 5.2 Iso-CPT和CPT对ECV304细胞的生长抑制作用及有效浓度
• 5.3 形态学观察凋亡细胞
• 5.4 流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡
• 5.5 Iso-CPT和CPT对ECV304细胞端粒酶活性的影响
• 5.6 Iso-CPT和CPT对ECV304细胞增殖抑制作用的比较
• 5.7 讨论
• 6 银屑病患者外周血单个核细胞端粒酶活性及与疾病严重程度的关系
• 6.1 前言
• 6.2 临床资料
• 6.3 淋巴细胞分离
• 6.4 端粒酶活性检测
• 6.5 相关性分析
• 6.6 讨论
• 7 hTERT反义基因对舌鳞癌Tca8113细胞端粒酶活性的影响
• 7.1 引言
• 7.2 hTERT基因的分离
• 7.3 反义表达质粒的鉴定及序列分析
• 7.4 外源基因在基因组DNA中整合的鉴定结果
• 7.4.1 PCR鉴定
• 7.4.2 Southern杂交分析
• 7.5 反义hTERT基因对端粒酶活性的影响
• 7.6 反义hTERT基因对细胞生长的影响
• 7.7 讨论
• 结论
• 参考文献
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表及完成的学术论文
• 致谢
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