用VIGS技术研究若干豌豆花同源异型基因的功能

论文摘要

利用基于豌豆早褐病毒（pea early browning virus,PEBV）的VIGS体系对豌豆的花同源异型转变的ABCE类代表基因PEAM4、PsPI、PsAG和PsSEP1/2的5’端对应编码MADS区的序列进行VIGS载体构建并进行病毒接种,对接种的植株进行表型观察并做遗传统计分析,结果表明,选择高度保守的区段进行VIGS可以将一类保守性高的同源基因沉默掉。另外对豌豆中APETALA1/FRUITFULL-Like同源基因PEAM4保守和特异区段及PsFUL保守区的VIGS构建并进行病毒接种。结果表明PsFUL保守区的VIGS在花型上变化不明显。同时,针对PEAM4,我们分别对其保守区段和特异区段做了VIGS构建,结果表明这两个构建都很好地模拟了其突变体pim的表型,它有两个突变形式,分别为pim-1和pim-2,具体表现为延迟了花分生组织的分化并对花的形态有很大影响,这类似于拟南芥APETALA1（AP1）突变体apl的表型。在野生型拟南芥中AP1通过抑制一组开花时间基因AGL24,SVP,SOC1来维持花分生组织的属性,防止花的逆转。在AP1缺失的情况下,这些基因异位表达。利用系统进化树分析,找了了在豌豆中SVP,SOC1的同源基因PsSOC1a和PSSVP,并利用定量PCR和原位杂交检测了它们在PEAM4沉默株里的表达模式,证明了PEAM4的VIGS丰富多样的表型,是由PsSOC1A和PsSVP异位表达引起的。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 AP1（APETALA1）基因分子机制研究进展
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 AP1作为一个花起始的协调因子起作用
• 1.1.3 AP1的上游调控机制
• 1.1.4 AP1的下游靶基因的识别
• 1.1.5 从抑制到激活:AP1相互作用蛋白的作用
• 1.1.6 AP1功能的保守性和创新点
• 1.1.7 展望
• 1.2 VIGS在同源基因保守区段共沉默上的研究进展
• 1.2.1 VIGS技术的原理
• 1.2.2 影响VIGS沉默效率的因素
• 1.2.3 VIGS技术在豌豆基因功能研究上的应用
• 1.2.4 花同源异型基因之间保守的相对性
• 1.2.5 展望
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 常用耗材
• 2.1.5 引物序列
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料的种植
• 2.2.2 植物总RNA提取
• 2.2.3 cDNA模板的制备
• 2.2.4 DNA聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.5 生物分析软件
• 2.2.6 VIGS实验
• 2.2.7 RNA原位杂交
• 3 实验内容和结果
• 3.1 豌豆中APETALA1/FRUITFULL-like同源基因功能的研究
• 3.1.1 野生型JI992中PEAM4的沉默导致豌豆花分生组织属性和花器官属性的改变
• 3.1.1.1 PEAM4基因特异区段的PEAM4S的VIGS构建
• 3.1.1.2 PEAM4S沉默植株表型分析
• 3.1.1.3 VIGS导致野生型豌豆中PEAM4基因mRNA表达水平减弱,同时在此背景下PsSVP和PsSOC1a的表达量上调
• 3.1.1.4 PsSVP、PsSOC1a分别在JI992野生型和PEAM4S-VIGS背景下的原位杂交
• 3.1.2 PEAM4基因包含MADS区的保守区段PEAM4C的VIGS
• 3.1.2.1 PEAM4基因包含MADS区的保守区段PEAM4C的VIGS构建
• 3.1.2.2 PEAM4C沉默植株表型分析
• 3.1.2.3 在PEAM4C-VIGS背景下,PEAM4、PsSVP和PsSOC1a基因表达的变化
• 3.1.3 PsFUL基因保守区段的VIGS
• 3.1.3.1 PsFUL基因保守区段的VIGS构建
• 3.1.3.2 PsFUL沉默植株表型分析
• 3.2 豌豆中四个ABCE类MADS-box基因PEAM4,PsPI,PsAG,PsSEP1/2 MADS区的VIGS构建
• 3.2.1 PEAM4基因对应MADS区的VIGS
• 3.2.1.1 PEAM4基因对应MADS区的VIGS载体的构建
• 3.2.1.2 PEAM4-MADS沉默植株表型分析
• 3.2.1.3 PEAM4的MADS区的VIGS背景下,PEAM4表达量的检测
• 3.2.2 PsPI基因对应MADS区的VIGS
• 3.2.2.1 PsPI基因对应MADS区的VIGS载体的构建
• 3.2.2.2 PsPI-MADS沉默植株表型分析
• 3.2.2.3 PsPI的MADS区的VIGS背景下,PsPI表达量的检测
• 3.2.3 PsAG基因对应MADS区的VIGS
• 3.2.3.1 PsAG基因对应MADS区的VIGS载体的构建
• 3.2.3.2 PsAG MADS沉默植株表型分析
• 3.2.3.3 PsAG基因对应MADS区的VIGS背景下,PsAG表达量的检测
• 3.2.4 PsSEP1/2基因对应MADS区的VIGS
• 3.2.4.1 PsSEP1/2基因对应MADS区的VIGS载体的构建
• 3.2.4.2 PsSEP1/2-MADS沉默植株表型分析
• 3.2.4.3 PsSEP1/2的MADS区的VIGS背景下,PsSEP1/2表达量的检测
• 4 小结
• 4.1 PEAM4-MADS的VIGS的构建和PsFUL保守区段的VIGS构建在株型上的相似性
• 4.2 PEAM4的VIGS的构建和PsSEP1/2的MADS区的VIGS构建的比较
• 4.2.1 不同点
• 4.2.2 相同点
• 5 分析和讨论
• 5.1 对豌豆花发育过程中属于MADS-box基因的ABCE类基因的相对保守性分析
• 5.2 对ABCE类中的MADS-box基因的MADS区VIGS的有效性分析
• 5.3 关于豌豆中开花诱导的分子机制的探究
• 参考文献
• 附录