论文摘要
目的观察限食后追赶生长大鼠模型中胰岛形态和功能变化及其可能的表观遗传学机制。方法48只5W龄雄性SD大鼠适应性喂养1W后,随机分为2组,即对照组（NC）（n=24）和限食后追赶生长组（CUGRF）（n=24）。两组整个实验过程中均给予普通饲料,其中NC组整个实验过程中均给予自由进食,CUGRF组前6周先给予同年龄NC组进食量的60%,然后开放自由进食,检测大鼠体重和进食量,分别于追赶生长0周、8周,12周和16周（开放进食0周、8周,12周和16周）时测定游离脂肪酸（FFA）,甘油三酯（TG）,胆固醇（TC）。分别于追赶生长0、8、16周时测定以下指标：高葡萄糖钳夹实验观察胰岛分泌功能；胰岛素免疫组化染色后计算胰岛面积,胰岛素阳性面积比率和平均光密度值；胰腺TUNEL染色计算胰岛β细胞凋亡率；胰腺Pdx-1,Bcl-2,Bax的实时定量PCR分析mRNA表达情况。分别于追赶生长0、8、16周时应用ChIP技术分析CUGFR和NC组大鼠的胰岛中提取的的交联染色质。免疫沉淀使用抗体为乙酰化H3抗体,H3K4me3抗体和H3K9me2抗体。以实时定量PCR检测结合到Pdx-1启动子上的乙酰化H3,H3K4me3和H3K9me2的相对量,以input DNA为校正值。结果1.限食后追赶生长动物模型的建立CUGFR组大鼠在限食6周内摄食量为NC组的60%。开放自由进食后CUGFR组大鼠进食量超过NC组（P<0.05）,开放2周后两组进食量比较差异无统计学意义（P>0.05）。CUGRF组大鼠限食期体重缓慢增加；开放进食后体重逐渐增加,从追赶第14周起与NC组差异无统计学意义（P>0.05）。追赶生长0周,8周,12周FFA水平无显著差异（P<0.05）；追赶生长16周时CUGFR组较NC组FFA显著升高（P<0.01）。追赶生长0周TG水平无显著差异（P<0.05）；开放进食后TG在两组间差异具有显著性（P<0.05）。在各个观察时间点CUGFR组与NC组TC相比差异均无统计学意义（P>0.05）2.限食后追赶生长大鼠胰岛形态和功能的变化CUGFR组空腹血糖和血清胰岛素在限食期结束时及自由进食后8周,16周与NC组相比差异无统计学意义（P>0.05）。但是在CUGFRO周,8周,16周胰岛素一相分泌显著低于NC组（分别为P<0.01,P<0.05,P<0.05）,其余各时间点与NC组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。图像分析结果显示,各观察时间点CUGFR组胰岛染色阳性面积比率均较NC组降低（P<0.05）。CUGFR组0周,8周胰岛素平均光密度值与同龄NC组相比无统计学差异（P>0.05）,16周CUGFR组胰岛素平均光密度值较NC组显著降低（P<0.01）。TUNEL染色显示追赶生长8周、16周两组胰岛凋亡率明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。CUGFR组胰腺Bcl-2 mRNA表达水平在限食后追赶生长各周均显著低于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）。Bax mRNA在追赶生长各周与NC组相比差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2/Bax比率在追赶生长0周时两组差异无统计学意义（P>0.05）追赶生长8周,16周时CUGFR组较NC组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。3.限食后追赶生长大鼠胰岛Pdx—1表达及其启动子区组蛋白甲基化修饰Real time PCR及western blot均显示CUGFR组胰腺Pdx-1 mRNA表达水平和蛋白水平较NC组在追赶生长各周均显著下降（P<0.05）。Pdx-1启动子乙酰化组蛋白H3的富集在CUGFR组0周、8周、16周随着年龄增长逐渐下降,与NC组相比差异有统计学意义（P<0.05）。在各个年龄大鼠NC组H3K4me3在Pdx-1启动子区高度富集,而CUGFR组H3K4me3的富集程度明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。ChIP检测发现NC组Pdx-1启动子H3K9me2富集程度较低,随着年龄增加CUGFR组H3K9me2较NC组富集程度显著升高（P<0.05）。结论限食后追赶生长过程中大鼠胰岛形态和胰岛分泌功能均发生了相应变化,胰岛素第一时相分泌功能明显受损,推测Pdx-1表达降低和胰岛凋亡增加共同参与了胰岛素一相分泌受损的病理过程。组蛋白修饰在限食后追赶生长大鼠模型中有显著变化,可能是Pdx-1基因表达下调的表观遗传学改变机制之一。第一部分限食后追赶生长动物模型的建立目的观察限食后开放进食对大鼠进食量、体重、血脂等指标的影响,从而构建出符合本实验要求的限食后追赶生长动物模型。评价血清GH, IGF-1, Ghrelin, leptin, CCK水平并与IUGR模型进行比较。方法48只5W龄雄性SD大鼠适应性喂养1W后,随机分为2组,即对照组（NC）（n=24）和限食后追赶生长组（CUGRF）（n=24）。两组整个实验过程中均给予普通饲料,其中NC组整个实验过程中均给予自由进食,CUGRF组前6周先给予同年龄NC组进食量的60%,然后开放自由进食。每天测大鼠体重和进食量,分别于追赶生长0周、8周,12周和16周（开放进食0周、8周,12周和16周）时测定血清游离脂肪酸（FFA）,甘油三酯（TG）,胆固醇（TC）,生长激素（GH）,胰岛素样生长因子-1（IGF-1）,胃饥饿素（ghrelin）,瘦素（leptin）,胆囊收缩素（CCK）等指标。结果1. CUGFR组大鼠在限食6周内摄食量为NC组的60%。开放自由进食后CUGFR组大鼠进食量超过NC组（P<0.05）,开放2周后两组进食量比较差异无统计学意义（P>0.05）。2. CUGRF组大鼠限食期体重缓慢增加；开放进食后体重逐渐增加,从追赶第14周起与NC组差异无统计学意义（P>0.05）。3.追赶生长0周FFA水平无显著差异（P<0.05）；追赶生长16周时CUGFR组较NC组FFA显著升高（P<0.01）。追赶生长0周TG水平无显著差异（P<0.05）；开放进食后TG在两组间差异具有显著性（P<0.05）。各个观察时间点CUGFR组与NC组TC相比差异无统计学意义（P>0.05）4. CUGFR组GH在追赶生长0周显著升高（P<0.05）,追赶8周时下降（P<0.01）,在追赶12、16周时两组差异无统计学意义（P>0.05）。CUGFR组leptin在追赶生长0周显著降低（P<0.05）,开放进食后各观察时间点leptin差异无统计学意义（P>0.05）。血清IGF-1, ghrelin, CCK浓度两组间在各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。结论本实验成功造成完全追赶生长大鼠模型,伴有FFA和TG水平升高,垂体激素GH、脂肪因子leptin在追赶生长大鼠模型中其分泌水平有显著变化并可能与胃肠神经肽CCK等能量平衡调节的因子共同参与了脂肪沉积,胰岛素抵抗状态的形成以及糖代谢障碍。第二部分限食后追赶生长大鼠胰岛形态和功能的变化目的观察限食后追赶生长大鼠胰岛形态和功能以及调节胰岛素分泌的关键转录因子的变化,初步探讨限食后追赶生长大鼠胰岛功能变化的可能机制。方法实验分组及造模方法同实验一。分别于追赶生长0、8、16周时测定以下指标：高葡萄糖钳夹实验观察胰岛分泌功能；胰岛素免疫组化染色后计算胰岛面积,胰岛素阳性面积比率和平均光密度值；胰腺TUNEL染色计算胰岛p细胞凋亡率；胰腺Bcl-2,Bax的实时定量PCR分析mRNA表达情况。结果1. CUGFR组空腹血糖和血清胰岛素在限食期结束时及自由进食后8周,16周与NC组相比差异无统计学意义（P>0.05）。限食结束后NC组在高葡萄糖刺激5min后,胰岛素水平显著升高,而CUGFR组的胰岛素基本保持在基础水平,分泌显著低于NC组（P<0.01）。CUGFR 8周葡萄糖负荷后10min时胰岛素分泌显著低于NC组（P<0.05）；16周时5min胰岛素分泌显著低于NC组（P<0.05）,其余各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。2.图像分析结果显示,CUGFR组0周,8周,16周的胰岛大小与同龄NC组相比均无统计学差异（P>0.05）。各周龄CUGFR组胰岛染色阳性面积比率均较NC组降低（P<0.05）。CUGFR组0周,8周胰岛素平均光密度值与同龄NC组相比无统计学差异（P>0.05）,16周CUGFR组胰岛素平均光密度值较NC组显著降低（P<0.01）3. TUNEL染色显示限食后追赶生长0周时CUGFR组和NC组凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。追赶生长8周、16周两组胰岛凋亡率明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。4. CUGFR组胰腺Bcl-2 mRNA表达水平在限食后追赶生长各周均显著低于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）。mRNA在追赶生长各周与NC组相比差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2/Bax比率在追赶生长0周时两组差异无统计学意义（P>0.05）追赶生长8周,16周时CUGFR组较NC组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论限食后追赶生长过程中大鼠胰岛凋亡增加,胰岛素第一时相分泌功能明显受损,可能与细胞凋亡增加有关。第三部分追赶生长大鼠胰岛Pdx-1启动子组蛋白修饰目的运用染色质免疫共沉淀技术研究限食后追赶生长大鼠模型Pdx-1表达水平和胰岛染色质Pdx-1基因启动子区乙酰化组蛋白H3,H3K4me3和H3K9me2的变化,以进一步探讨限食后追赶生长可能引起β细胞功能损伤的表观遗传学机制。方法实验分组及造模方法同第二部分。分别于追赶生长0、8、16周时用实时定量PCR分析胰腺Pdx-1 mRNA表达；Western blot方法检测Pdx-1蛋白表达；应用ChIP技术分析CUGFR和NC组大鼠的胰岛中提取的的交联染色质。免疫沉淀使用抗体为乙酰化H3抗体,H3K4me3抗体和H3K9me2抗体。以实时定量PCR检测结合到Pdx-1启动子上的乙酰化H3,H3K4me3和H3K9me2的相对量,以input DNA为校正值。结果Real time PCR及western blot均显示CUGFR组胰腺Pdx-1 mRNA表达水平和蛋白水平均较NC组在追赶生长各周均显著下降（P<0.05）。Pdx-1启动子乙酰化组蛋白H3的富集在CUGFR组0周、8周、16周随着年龄增长逐渐下降,与NC组相比差异有统计学意义（P<0.05）。在各个年龄大鼠NC组H3K4me3在Pdx-1启动子区高度富集,而CUGFR组H3K4me3的富集程度明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。ChIP检测发现NC组Pdx-1启动子H3K9mc2富集程度较低,随着年龄增加CUGFR组H3K9me2较NC组富集程度显著升高（P<0.05）。结论限食后追赶生长使Pdx-1基因表达下调,组蛋白修饰的显著变化可能是导致其表达下调的表观遗传学改变机制之一。
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