梨抗黑星病相关基因功能及转化砀山酥梨的研究

论文摘要

砀山酥梨（Pyrus bretschneideri cv. Dangshansu）原产于安徽省砀山地区,是我国栽培历史较早的一个优良品种,但其最大的缺点是易感染梨黑星病,给果农和果商带来巨大的经济损失。培育抗黑星病的品种是解决该问题的根本途径之一。本研究以砀山酥梨为材料,建立砀山酥叶片再生不定芽体系,通过农杆菌介导法转化课题组已获得的‘早酥’梨黑星病病原菌诱导的特异表达基因PzsREMORIN（GenBank登录号:HQ901373）和Pzs25 （GenBank登录号:HQ901368）,转入砀山酥梨,以期获得抗黑星病的转基因植株,并对相关基因进行了功能分析,取得的主要结果如下:1、重组原核表达载体pGEX-PbzsREMORIN和pGEX-Pbzs25转入大肠杆菌E.coli BL21中,在IPTG的诱导下两个基因都得到了表达。2、瞬时表达显示PbzsREMORIN蛋白在整个细胞中都有表达,而Pbzs25只在细胞核中表达。3、通过基因PbzsREMORIN转化烟草研究结果表明该基因在植物与病原菌互作过程中起重要作用。4、采用无菌苗顶部幼嫩叶片为外植体,研究基本培养基、植物激素种类组成和浓度配比对叶片再生有重要影响。结果表明, NN69培养基适宜于砀山酥梨叶片再生, 3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IBA为最佳的激素组合。5、用梨本身代谢的山梨醇作为叶片再生不定芽的碳源比蔗糖外植体再生率高,最佳浓度是10 mg·L-1 ,叶片再生频率最高为74.03%,平均再生芽数1.01;AgN03比其他抗氧化剂PVP和活性炭抗氧化效果更好,0.5 mg·L-1 AgN03的可显著地提高砀山酥梨叶片再生频率。6、生根培养基以1/4MS +20 mg·L-1 IBA+40 mg·L-1 PG+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂,暗培养7天为佳,生根率高且根粗壮。7、Kan霉素不适合作为砀山酥梨遗传转化的筛选抗生素,新霉素浓度为50 mg·L-1适合作为筛选压;抗生素Cef浓度为300 mg·L-1时,梨叶片再生率较高又能控制住农杆菌的生长。8、在农杆菌浓度为OD600为0.5时,侵染5min,共培养2天,延迟培养5天是砀山酥梨叶片遗传转化比较好的优化条件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 梨抗黑星病相关基因的研究进展
• 1.2 梨组织培养的研究进展
• 1.2.1 器官发生途径
• 1.2.2 胚状体发生途径
• 1.2.3 其他形式的离体培养
• 1.3 梨遗传转化研究进展
• 1.3.1 转入的外源基因类型
• 1.3.2 转基因的主要方法
• 1.3.3 影响遗传转化的因素
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 抗黑星病相关基因的功能验证
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 主要试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 原核表达
• 2.2.2 亚细胞定位
• 2.2.3 转化烟草研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 原核表达
• 2.3.2 亚细胞定位
• 2.3.3 PbzsREMORIN 基因转化烟草
• 2.4 讨论
• 第三章 砀山酥梨叶片再生体系的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂及仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 无菌系的建立
• 3.2.2 叶片再生不定芽的诱导
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 叶片再生不定芽
• 3.3.2 不同基本培养基对‘砀山酥’梨叶片再生的影响
• 3.3.3 不同激素浓度对不定芽再生的影响
• 3.3.4 不同抗氧化剂对叶片再生的影响
• 3.3.5 碳源对不定芽再生的影响
• 3 对‘砀山酥’梨叶片再生的影响'>3.3.6 不同浓度AgNO₃对‘砀山酥’梨叶片再生的影响
• 3.3.7 培养基、IBA 浓度、间苯三酚浓度、蔗糖浓度、暗培养天数对不定芽生根的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 根癌农杆菌介导砀山酥梨叶片遗传转化
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株和质粒
• 4.1.3 主要试剂及仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 抗病相关基因过量表达载体的构建
• 4.2.2 根癌农杆菌的活化与培养
• 4.2.3 Kan Neo 霉素敏感试验
• 4.2.4 Cef 筛选浓度的确定
• 4.2.5 农杆菌侵染时间的确定
• 4.2.6 共培养时间对叶片转化的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Kan Neo 霉素敏感试验
• 4.3.2 Cef 敏感试验
• 4.3.3 农杆菌侵染时间的确定
• 4.3.4 共培养时间对叶片转化的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 5.1 抗病相关基因的功能验证
• 5.2 砀山酥梨叶片再生
• 5.3 砀山酥梨遗传转化
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介