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酶法合成15NL-苯丙氨酸及苯丙氨酸解氨酶初步纯化的研究

2020-11-22阅读(238)

酶法合成15NL-苯丙氨酸及苯丙氨酸解氨酶初步纯化的研究

论文摘要

15NL-苯丙氨酸（15NL-Phe）稳定、无放射性,使用安全、方便,作为示踪剂,在医学、生物及化工等领域越来越受到重视。迄今为止,只有Hadener A.等报道合成L-phenyl-[2-13C,15N]alanine的研究,产品纯度与收率均低,分别为62.9%和29%。因此,改进15NL-Phe的工艺,获得高纯度、高丰度、高收率的标记产品,对15NL-Phe的扩大生产有非常重要的意义。苯丙氨酸解氨酶既可治疗苯丙酮尿症及癌症,又可固定化用于L-Phe的生产,因此该酶的分离纯化有很大的应用价值。本文基于实验室前阶段的研究成果,对粘红酵母（Rhodotorula glutinis）苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化肉桂酸和15N氨生成15NL-Phe的反应进行了深入研究,找到一条具应用前景的15NL-Phe生产路线。此外,通过胞内PAL酶的释放及双水相法提取PAL的研究,提出一种胞内PAL酶初步纯化的新方法。研究内容包括如下几部分：在苯丙氨酸解氨酶法产酸反应中,PAL酶活是控制产酸的关键,但PAL易失活,15NL-Phe的产酸能力受到限制,因此寻找稳定PAL酶活的方法对提高产酸能力至关重要。实验考察了酶反应中几种效应物PEG6000、海藻糖、二巯基苏糖醇、D-山梨醇、甘油和戊二醛对PAL酶的稳定作用,发现0.5%PEG6000对PAL酶的稳定作用最显著,比对照酶活提高80.3%。响应面实验发现效应物组合0.62%海藻糖、0.54%聚乙二醇6000和0.31%巯基苏糖醇稳定PAL酶活效果较好,比对照酶活提高92.9%。15NL-Phe合成反应所用的PAL酶受底物肉桂酸的强烈抑制作用,因此缓解或削弱此抑制作用对增大产酸能力尤为重要。实验考察了β-环糊精对此抑制的缓解作用。当体系肉桂酸量因转化而减少时,β-环糊精释放包合的肉桂酸,使更多的肉桂酸参与转化,缓解高浓度肉桂酸对PAL酶的抑制作用,提高产酸能力。向酶反应混合物中添加与肉桂酸摩尔比为0.13的β-环糊精,可使肉桂酸抑制浓度由135mmol/L上升到270mmol/L;肉桂酸浓度为270mmol/L时,产酸能力比未添加β-环糊精的对照高出166.7%。从PAL酶动力学角度分析β-环糊精对酶促反应的影响,发现最大产物生成速率γmax及抑制解离常数Ki均增大,米氏常数Km减小,进一步说明β-环糊精有缓解高浓度肉桂酸对酶抑制的作用,促进反应向产物方向进行。若同时流加肉桂酸,可比未采取这两项措施的对照产酸高出202.0%。反应产物经离心除细胞、酸沉肉桂酸、除杂蛋白后,产物溶液中还有少量铵盐及其它氨基酸和无机盐。HP20大孔吸附树脂可使酸与盐有效分离并脱除非极性色素,吸附洗脱后15NL-Phe树脂分离的总收率为91.2%,NH4+总收率为95.2%。将洗脱液调pH值到等电点附近,70℃下真空旋转蒸发,加无水乙醇并投微量15NL-Phe晶种,室温下自然结晶4h,4℃下继续结晶24h,将结晶过滤、干燥,母液回收再结晶,结晶率为90.2%,晶体纯度大于99%,15NL-Phe产品总收率为71.1%,远高于报道的纯度62.9%和收率29%。以丰度为5.34%的（15NH4）2SO4为氮源,反应获得的15NL-Phe丰度为5.1%（15NH4）2SO4回收率为82.1%,（15NH4）2SO4得到有效回收,降低了生产成本。PAL酶释放的研究发现：超声破碎法好于冷冻法；温和渗透剂甘氨酸与丙氨酸不利于酶的释放；TritonX-100可显著释放PAL酶；先加入TritonX-100渗透6h再超声破碎,蛋白释放率达76.7%,PAL酶收率为70.3%,是单独使用超声破碎的112%和128%。因此,超声破碎与TritonX-100联用是释放粘红酵母胞内PAL酶的有效手段。PEG/无机盐双水相法纯化Rhodotorula glutinis胞内PAL酶的研究发现：PAL在PEG/无机盐体系的分配受疏水效应、界面电势、排空效应及盐析效应的影响。通过考察PEG分子量、盐及电解质种类及浓度对PAL分配的影响,发现一条两步法纯化PAL的途径,即分别使用11.0%PEG1000/14.0%Na2SO4（pH8.8）和11.0%PEG1000/14.0%Na2SO4/53%Na2CO3（pH8.8）组成的双水相,两步分配后PAL的收率为80.6%,纯化系数为9.3,与传统盐析纯化法收率相当,但纯化系数为后者的3.7倍,因此,PEG1000/Na2SO4双水相两步法为粘红酵母Rhodotorula glutinis胞内PAL粗酶的纯化提供了一条新途径。

论文目录

  • 学位论文数据集
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 15NL-苯丙氨酸的性质'>1.115NL-苯丙氨酸的性质
  • 15NL-苯丙氨酸的物理性质'>1.1.115NL-苯丙氨酸的物理性质
  • 15NL-苯丙氨酸的化学性质'>1.1.215NL-苯丙氨酸的化学性质
  • 15NL-苯丙氨酸的应用'>1.215NL-苯丙氨酸的应用
  • 1.2.1 L-苯丙氨酸的应用
  • 15NL-苯丙氨酸的应用'>1.2.2 同位素标记的氨基酸及15NL-苯丙氨酸的应用
  • 1.2.2.1 同位素标记的氨基酸在医学上的应用
  • 1.2.2.2 同位素标记的氨基酸在生物学上的应用
  • 1.2.2.3 同位素标记的氨基酸在药学上的应用
  • 15NL-苯丙氨酸的应用'>1.2.2.415NL-苯丙氨酸的应用
  • 15NL-苯丙氨酸的制备'>1.315NL-苯丙氨酸的制备
  • 1.3.1 L-苯丙氨酸的制备
  • 1.3.1.1 提取法
  • 1.3.1.2 化学合成法
  • 1.3.1.3 发酵法
  • 1.3.1.4 酶法
  • 1.3.1.5 苯丙氨酸解氨酶法
  • 15NL-苯丙氨酸的制备'>1.3.215NL-苯丙氨酸的制备
  • 15NL-苯丙氨酸的分离与纯化'>1.415NL-苯丙氨酸的分离与纯化
  • 1.4.1 L-苯丙氨酸分离与纯化技术
  • 15NL-苯丙氨酸'>1.4.2 HP20大孔吸附树脂法分离与纯化15NL-苯丙氨酸
  • 15NL-苯丙氨酸的分析方法'>1.515NL-苯丙氨酸的分析方法
  • 1.6 苯丙氨酸解氨酶的分离与纯化
  • 1.6.1 PAL酶分离纯化方法
  • 1.6.2 PAL酶的释放
  • 1.6.2.1 植物及微生物细胞中PAL酶的释放
  • 1.6.2.2 细胞破碎技术的研究进展
  • 1.6.3 水相法分离纯化PAL酶
  • 1.7 研究的目的和意义
  • 1.8 研究思路及内容
  • 参考文献
  • 第二章 效应物对苯丙氨酸解氨酶活性的影响
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 化学试剂
  • 2.1.2 仪器与设备
  • 2.1.3 菌种
  • 2.1.4 培养基
  • 2.1.5 培养方法及转化方法
  • 2.1.6 酶促反应转化条件
  • 2.1.7 L-苯丙氨酸含量的测定
  • 2.1.8 PAL相对酶活力的判定
  • 2.2 结果与讨论
  • 2.2.1 聚乙二醇6000（PEG6000）对酶活的影响
  • 2.2.2 海藻糖对酶活的影响
  • 2.2.3 二巯基苏糖醇（DTT）对酶活的影响
  • 2.2.4 D-山梨醇对酶活的影响
  • 2.2.5 甘油对酶活的影响
  • 2.2.6 戊二醛对酶活的影响
  • 2.2.7 响应面实验
  • 2.3 小结
  • 参考文献
  • 第三章 β-环糊精对酶反应的影响
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 化学试剂
  • 3.1.2 仪器与设备
  • 3.1.3 菌种
  • 3.1.4 培养基
  • 3.1.5 培养方法及转化方法
  • 3.1.6 酶促反应转化条件
  • 3.1.7 L-苯丙氨酸含量的测定
  • 3.1.8 PAL酶活测定
  • 3.2 结果与讨论
  • 3.2.1 肉桂酸对酶的抑制作用
  • 3.2.2 β-环糊精对产酸的影响
  • 3.2.3 高于肉桂酸抑制浓度时,不同添加量的β-环糊精对产酸的影响
  • 3.2.4 不同β-环糊精添加量对肉桂酸抑制浓度的影响
  • 3.2.5 添加β-环糊精及流加肉桂酸对酶促反应的影响
  • 3.2.6 β-环糊精对酶反应的动力学效应
  • 3.3 小结
  • 参考文献
  • 15NL-苯丙氨酸的分离与纯化'>第四章15NL-苯丙氨酸的分离与纯化
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 化学试剂
  • 4.1.2 仪器与设备
  • 4.1.3 上柱液预处理
  • 4.1.4 树脂预处理
  • 4.1.5 吸附
  • 4.1.6 洗脱
  • 4.1.7 样品脱色
  • 4.1.8 结晶
  • 4.1.9 L-苯丙氨酸的检测
  • 4.1.9.1 茚三酮定性检测
  • 4.1.9.2 HPLC检测
  • 4.1.10 肉桂酸检测
  • 4.1.11 蛋白检测
  • 4.1.12 凯氏定氮
  • 4.1.13 质谱分析
  • 4.1.14 核磁共振分析
  • 4.2 结果与讨论
  • 4.2.1 产物的预处理
  • 4.2.2 HP20大孔树脂对L-Phe吸附条件的确定
  • 4.2.2.1 样液浓度和温度对L-Phe在HP20树脂静态吸附量的影响
  • 4.2.2.2 pH值对HP20大孔吸附树脂L-Phe静态吸附量的影响
  • 4.2.2.3 样液L-Phe浓度对HP20动态吸附L-Phe穿透的影响
  • 4.2.2.4 上柱流速对HP20动态吸附L-Phe穿透的影响
  • 4.2.2.5 L-Phe浓度对HP20树脂L-Phe动态吸附率的影响
  • 4+浓度对HP20分离铵盐的影响'>4.2.2.6 样液中NH4+浓度对HP20分离铵盐的影响
  • 4.2.2.7 吸附流速对L-Phe吸附及铵盐分离的影响
  • 4.2.3 HP20大孔树脂上L-Phe洗脱条件的确定
  • 4.2.3.1 HP20大孔吸附树脂洗脱剂的选择
  • 4.2.3.2 去离子水对HP20大孔树脂吸附L-Phe的动态洗脱曲线
  • 4.2.3.3 60%乙醇水溶液对HP20吸附L-Phe的动态洗脱曲线
  • +洗脱率的影响'>4.2.3.4 水洗脱速度对L-Phe及NH4+洗脱率的影响
  • 4.2.3.5 1.0BV/h水洗脱速度下L-Phe动态洗脱曲线
  • 15NL-Phe的浓缩、脱色与结晶'>4.2.415NL-Phe的浓缩、脱色与结晶
  • 4.2.4.1 产品的脱色
  • 15NL-Phe纯度与丰度分析'>4.2.4.215NL-Phe纯度与丰度分析
  • 15NH4)2SO4的回收'>4.2.5 原料(15NH4)2SO4的回收
  • 15NL-Phe分离纯化产品收率及铵盐回收总核算'>4.2.615NL-Phe分离纯化产品收率及铵盐回收总核算
  • 15NL-Phe工艺的经济效益估算'>4.2.7 苯丙氨酸解氨酶法生产15NL-Phe工艺的经济效益估算
  • 4.3 小结
  • 参考文献
  • 第五章 粘红酵母Rhodotorula glutinis胞内苯丙氨酸解氨酶释放的研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 化学试剂
  • 5.1.2 仪器与设备
  • 5.1.3 菌种
  • 5.1.4 粘红酵母湿细胞的制备
  • 5.1.5 PAL酶活的测定
  • 5.1.6 蛋白的测定
  • 5.1.7 细胞破碎率的测定
  • 5.2 结果与讨论
  • 5.2.1 液氮低温断裂对酶释放的影响
  • 5.2.2 超声波破碎对酶释放的影响
  • 5.2.3 温和渗透剂对PAL酶活和释放的影响
  • 5.2.4 其它化学渗透剂对PAL酶活及释放的影响
  • 5.2.5 超声与Triton渗透联用对酶释放和酶活的影响
  • 5.3 结论
  • 参考文献
  • 第六章 双水相法提取胞内苯丙氨酸解氨酶的研究
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 化学试剂
  • 6.1.2 仪器与设备
  • 6.1.3 菌种
  • 6.1.4 培养基
  • 6.1.5 培养方法
  • 6.1.6 粗酶的制备
  • 6.1.7 双水相体系的制备
  • 6.1.8 PAL酶活的测定
  • 6.1.9 蛋白的测定
  • 6.2 结果与讨论
  • 6.2.1 PAL在PEG/无机盐体系中的分配
  • 4）2SO4ATPS中的分配'>6.2.1.1 PAL在PEG/（NH4）2SO4ATPS中的分配
  • 2SO4 ATPS中的分配'>6.2.1.2 PAL在PEG/Na2SO4ATPS中的分配
  • 2CO3ATPS中的分配'>6.2.1.3 PAL在PEG/Na2CO3ATPS中的分配
  • 6.2.1.4 PAL在PEG/potassium phosphate ATPS中的分配
  • 2SO4 ATPS分配的影响'>6.2.2 电解质对PAL在11.0%PEG1000/14.0%Na2SO4ATPS分配的影响
  • 2SO4 ATPS两步法提取粘红酵母胞内PAL'>6.2.3 PEG1000/Na2SO4ATPS两步法提取粘红酵母胞内PAL
  • 6.3 小结
  • 参考文献
  • 第七章 结论与展望
  • 7.1 结论
  • 7.2 展望与建议
  • 论文创新点
  • 研究成果及发表的学术论文
  • 致谢
  • 作者简介
  • 导师简介
  • 附件

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