乌拉尔甘草AFLP遗传多样性及离体培养技术研究

论文摘要

乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）属于豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza）灌木状多年生草本植物,是荒漠半荒漠地区重要的防风固沙植物,既有重要的药用价值,在食品、饮料、卷烟、化妆品等工业中也有着重要的作用。由于对野生资源的毁灭性采挖,造成种群数量减少,遗传多样性受到严重威胁,开展对野生乌拉尔甘草遗传多样性和植物组织培养技术研究对于资源保护和人工栽培育种具有重要的理论和实践意义。本文利用AFLP标记分析了来自我国乌拉尔甘草主产区共18个野生种群的遗传多样性,并对愈伤组织的诱导、状态调控、离体再生、微繁体系建立以及有效成分甘草酸和黄酮的合成和积累进行了研究,结果如下: 1.筛选了15对条带清晰、多态性丰富的AFLP引物组合对18个野生乌拉尔甘草种群360个单株共扩增出759条谱带,其中多态性带527条,占69.43%,平均每个位点有35.1个等位变异。 2.野生乌拉尔甘草具有一定的遗传多样性水平,Nei′基因多样性指数在0.13～0.19之间,平均为0.25;Shannon多态性信息指数的变异范围在0.19～0.28之间,平均为0.39;宁夏地区种群遗传多样性水平最高,其次为内蒙古地区、新疆地区、黑龙江地区和山西地区,甘肃酒泉种群的遗传多样性水平最低。供试18个种群中,遗传变异最丰富的是宁夏灵武种群。18个供试种群遗传相似系数在0.8559～0.9679之间,变幅为0.112。种群间的遗传距离在0.0326～0.1556。利用UPGMA聚类将供试18个群体划分为4类,聚类结果表现出明显的地域性。 3.建立了适合乌拉尔甘草组织培养物中总黄酮提取和含量测定的工艺方法,以75%甲醇为溶剂、浸泡6小时、在32℃下超声提取5分钟2次,以甘草苷为对照品利用碱性比色法进行测定,该体系稳定性和重复性均较好,回收率在95%～101.4%。 4.适宜乌拉尔甘草下胚轴、胚根和子叶愈伤组织诱导的激素组合分别为2,4-D0.5mg/L+6BA1.0～2.0mg/L,2,4-D0.5mg/L+6BA2.0mg/L或2,4-D1.0mg/L+6BA2.0mg/L,KT不适合乌拉尔甘草愈伤组织诱导。对四种不同类型的初代愈伤组织进行状态调控,连续继代培养不能改变原有状态,改变激素种类比改变激素浓度更有效。 5.乌拉尔甘草形态建成有两种方式,直接器官形成,以MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.1mg/L,间接器官形成以下胚轴为外植体时,分化率52%,子叶愈伤组织经调控后在MS+NAA0.2mg/L+BA0.1mg/L+KT0.1mg/L或MS+

论文目录

• 引言
• 1 甘草的概况
• 2 甘草资源的历史和现状
• 3 甘草相关研究进展
• 4 立题依据及研究内容
• 第一章 乌拉尔甘草AFLP遗传多样性
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 仪器和试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 DNA提取方法
• 1.3.2 AFLP体系
• 1.3.3 结果统计与数据分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 乌拉尔甘草的取样与DNA提取
• 2.2 乌拉尔甘草AFLP多态性引物筛选
• 2.3 乌拉尔甘草种群的多态性条带比率
• 2.4 乌拉尔甘草的遗传多样性指数分析
• 2.5 乌拉尔甘草的遗传结构
• 2.6 乌拉尔甘草种群间的遗传分化
• 3 讨论
• 3.1 乌拉尔甘草的遗传多样性
• 3.2 乌拉尔甘草群体遗传变异的组成
• 3.3 乌拉尔甘草资源保护的策略
• 4 结论
• 第二章 乌拉尔甘草微繁体系构建及植株再生
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 无菌苗培养
• 1.2.2 培养条件的选择
• 1.2.3 离体培养植株再生体系构建
• 1.2.4 微繁体系的建立
• 1.2.5 各种培养物中总黄酮含量的测定
• 1.2.6 甘草酸含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 乌拉尔甘草组织培养物中总黄酮含量测定体系的确立
• 2.1.1 检测波长和最大吸收峰的确定
• 2.1.2 10％KOH用量及显色时间的确定
• 2.1.3 标准曲线的制作
• 2.1.4 黄酮提取方法的优化
• 2.1.5 精密度实验
• 2.1.6 重现性实验
• 2.1.7 回收率实验
• 2.2 不同外植体初代愈伤组织的诱导
• 2.2.1 不同培养条件下形成初代愈伤组织的差异性
• 2.2.2 不同浓度的6BA对初代愈伤组织的影响
• 2.2.3 不同浓度的KT对初代愈伤组织的影响
• 2.2.4 不同基因型初代愈伤组织的差异性
• 2.3 愈伤组织状态调控技术
• 2.3.1 初代愈伤组织状态的调控
• 2.3.2 不同植物生长调节剂对子叶愈伤组织状态的调控
• 2.3.3 不同光照条件对愈伤组织中总黄酮含量的影响
• 2.4 乌拉尔甘草器官发生类型及频率
• 2.5 乌拉尔甘草快速高效微繁体系的建立
• 2.5.1 取材方法
• 2.5.2 表面消毒的效果
• 2.5.3 正交设计法诱导甘草丛生芽形成
• 2.5.4 芽的增殖
• 2.5.5 试管苗的生根
• 2.5.6 试管苗的移栽
• 2.6 乌拉尔甘草试管苗总黄酮含量的积累
• 2.6.1 不同生根剂对乌拉尔甘草试管苗总黄酮含量积累的影响
• 2.6.2 不同培养天数试管苗总黄酮含量的积累
• 3 讨论
• 3.1 乌拉尔甘草离体培养物中总黄酮含量测定体系
• 3.2 微繁体系的建立及应用
• 3.3 培养物中次生代谢物的积累
• 3.4 今后关于甘草研究的工作设想
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢