黏着斑激酶基因沉默促进口腔癌细胞失巢凋亡的实验研究

论文摘要

正常实体组织细胞具有锚着依赖性生存（anchor-dependentsurvival）的特点,在脱黏附状态下会发生凋亡（细胞自身控制的程序化死亡）,即失巢凋亡（anoikis）。然而,转移的癌细胞则具有抗失巢凋亡的生存能力,这也是其发生远处转移的生物学机制之一。粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是一种非受体酪氨酸激酶,通过多种信号通路在细胞生长调节、侵袭、转移、细胞周期调控等多方面发挥了重要作用。FAK在细胞内如细胞与细胞外基质的相互作用、细胞生长信号转导中发挥重要的作用。另外,FAK与失巢凋亡密切相关,尽管其具体机制还未完全阐述清楚,但已经有研究证实P13K（磷脂酰肌醇-3-激酶）,p130cas,p53和ERK（有丝分裂素激活蛋白激酶）的相互作用在FAK介导的细胞生存信号中发挥重要作用。学者们通过人工的方法使多种细胞株中FAK的表达增加,结果显著抑制细胞的失巢凋亡,并且赋予细胞恶性表型。相反,在胃心肌细胞中,当应用FAK相关非激酶使FAK的表达被抑制时,黏附依赖的相关信号则同时被抑制。综合以上分析,我们提出假设,FAK因沉默可能促进失巢凋亡,逆转口腔癌细胞失巢凋亡抗性,进而抑制其转移。第一部分靶向黏着斑激酶siRNA表达载体构建及转染目的:构建靶向黏着斑激酶（focal adhension kinase,FAK）基因的小干涉RNA（small interfering RNA,siRNA）质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用。方法:将靶向黏着斑激酶siRNA表达载体重组质粒转染至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用荧光显微镜、免疫细胞化学和Western-blot鉴定FAK的沉默效应。结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;荧光显微镜观察结果显示重组质粒成功转染细胞;免疫细胞化学和Western-blot结果显示转染靶向黏着斑激酶siRNA表达载体后,FAK基因的表达受到明显抑制。结论:成功构建了针对人FAK的干扰重组质粒,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制Tca8113细胞中FAK的表达。第二部分FAK基因沉默对口腔癌细胞失巢凋亡抗性的影响目的:观察黏着斑激酶（focal adhension kinase,FAK）基因沉默对口腔舌癌细胞株Tca8113失巢凋亡抗性的影响,探讨FAK基因与口腔鳞癌转移特性的关系。方法:以舌癌细胞株Tca8113为研究对象,将FAK基因沉默前后的细胞分别在普通单层贴壁和悬浮条件下培养,24小时后,流式细胞仪观察FAK对口腔舌癌细胞株Tca8113体外培养过程抗失巢凋亡的影响。结果:舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中具有较强的抗失巢凋亡特性。特异性siRNA可以抑制FAK基因的表达。FAK基因干扰后,Tca8113细胞的失巢凋亡显著提高（P＜0.01）。结论:FAK基因沉默可以逆转舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中的抗失巢凋亡特性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录（发表文章）
• 致谢
• 综述及参考文献