番茄叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因（LeFAD7）的克隆及其在温度逆境下的功能分析

论文摘要

温度是限制植物生长、发育及产量的重要环境因子。当植物遭受温度逆境胁迫时,生物膜系统被认为是最先受到伤害的部位。植物体内膜脂不饱和脂肪酸含量越高,膜脂相变温度就越低,低温抗性就越强。反之,则相变温度越高,高温抗性越强。ω-3脂肪酸去饱和酶是不饱和脂肪酸合成途径中催化16:2（7,10）或18:2（9,12）转化为16:3（7,10,13）或18:3（9,12,15）的关键酶。其含量的变化能改变膜脂中脂肪酸的组成,尤其是三烯脂肪酸的水平,进而影响相变温度,改变植株对温度胁迫的抗性。本研究从番茄叶片中分离到番茄叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因。表达模式和功能分析表明,该基因的表达受低温、水分、盐胁迫诱导,受高温胁迫抑制。抑制该基因表达可提高番茄植株的耐热性,而过量表达该基因则增强番茄植株的耐冷性。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,先通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的中间片段,然后采用RACE的方法分别克隆到5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。该基因全长为1683 bp,ORF为1308 bp,编码435个氨基酸,分子量约为50 kD。将其在GenBank注册,注册号为AY157317。2.同源序列比较发现,番茄叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的序列与马铃薯、甜椒、烟草、芥菜型油菜的质体型ω-3脂肪酸去饱和酶基因同源性很高,分别为96%、92%、89%和85%。同时,进化分析表明,该基因聚类到叶绿体型FAD7类ω-3脂肪酸去饱和酶,因此将其命名为LeFAD7基因。该酶蛋白为膜蛋白,有三个跨膜信号区, N端有一段叶绿体转运肽。结构同源性分析表明LeFAD7有四个序列保守的结构域,其中后三个保守区富含组氨酸,是维持其膜结合类酶特性所必须的。3. Southern杂交结果表明,LeFAD7基因在番茄基因组中是单拷贝的,是编码番茄ω-3脂肪酸去饱和酶多基因家族中的一员。Northern杂交结果表明LeFAD7基因在不同器官中呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高,尤以幼嫩叶片中表达量最高,且受发育时期的调控。同时,该基因在所有生长温度范围内（4-40℃）均有表达,受低温、水分（20% PEG）、盐（200 mM NaCl）胁迫诱导,且在三种胁迫下叶片内源表达量呈现先升高,然后降低,接着再升高的双峰表达模式,高温胁迫抑制其表达。4.将获得的LeFAD7基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转入番茄中,通过5‰的卡那霉素筛选,获

论文目录

• 英文缩略表
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• 1. 引言
• 1.1 温度对植物光合作用的影响
• 1.1.1 低温对植物光合作用的影响
• 1.1.2 高温对植物光合作用的影响
• 1.2 温度对植物生物膜的影响
• 1.2.1 植物生物膜的组成
• 1.2.2 低温对植物生物膜的影响
• 1.2.3 高温对植物生物膜的影响
• 1.3 多不饱和脂肪酸的合成
• 1.3.1 多不饱和脂肪酸的种类
• 1.3.2 多不饱和脂肪酸的生物合成
• 1.4 PUFAs 尤其是 ALA 合成过程中相关酶的研究
• 1.4.1 除ALA 外的PUFAs 合成过程中相关酶的研究
• 1.4.2 ALA 合成过程中关键酶（ω-3 脂肪酸去饱和酶）的研究
• 1.5 本研究的目的、意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料与处理
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 利用TRIZOL试剂盒提取RNA
• 2.2.2 RNA 反转录
• 2.2.3 番茄叶绿体ω-3 脂肪酸去饱和酶基因全长的克隆
• 2.2.4 番茄ω-3去饱和酶基因的克隆及测序
• 2.2.5 Northern 杂交
• 2.2.6 Southern 杂交
• 2.2.7 表达载体的构建
• 2.2.8 电泳目的基因片段的回收
• 2.2.9 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备及转化
• 2.2.10 转基因番茄植株的 PCR 检测
• 2.3 转基因番茄生理指标的测定
• 2.3.1 转基因番茄叶片膜脂含量的测定方法
• 2.3.2 光合气体交换参数的测定
• 2.3.3 放氧活性的测定
• 2.3.4 荧光参数测定
• 2.3.5 P700 的820 nm 光吸收
• 2.3.6 活性氧清除酶的活性测定
• 2.3.7 可溶性蛋白的测定
• 2.3.8 叶片电导率的测定
• 2.3.9 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.3.10 花粉活性的测定
• 2.3.11 扫描电镜样品的制作与观察
• 3. 结果与分析
• 3.1 LeFAD7基因的克隆
• 3.1.1 番茄叶片RNA的提取及反转录
• 3.1.2 基因中间片段的克隆
• 3.1.3 番茄ω-3 脂肪酸去饱和酶基因3' 端的克隆
• 3.1.4 番茄ω-3 脂肪酸去饱和酶基因5' 端的克隆
• 3.1.5 番茄ω-3脂肪酸去饱和酶基因全长的克隆
• 3.2 番茄ω-3脂肪酸去饱和酶基因特性分析
• 3.2.1 基因序列同源性分析
• 3.2.2 LeFAD7基因编码蛋白的生化特性分析
• 3.3 LeFAD7 基因表达特性分析
• 3.3.1 LeFAD7 基因Southern 杂交分析
• 3.3.2 LeFAD7 基因Northern 杂交分析
• 3.4 LeFAD7 基因转化番茄
• 3.4.1 正、反义表达载体的构建
• 3.4.2 正、反义克隆载体的鉴定
• 3.4.3 正、反义表达载体的检测
• 3.4.4 质粒 PBIHFAD（+）和 PBIHFAD（-）转化农杆菌
• 3.4.5 LeFAD7 基因在番茄中的遗传转化
• 3.5 转反义LeFAD7 基因植株的鉴定与功能分析
• 3.5.1 转反义LeFAD7 基因植株的分子检测
• 3.5.2 抑制LeFAD7 基因表达改变类囊体膜脂的组成
• 3.5.3 抑制LeFAD7 基因表达对高温胁迫下叶片光合速率的影响
• 3.5.4 抑制LeFAD7 基因表达增加高温胁迫下植株的生长量
• 3.5.5 高温胁迫下抑制LeFAD7 基因表达对番茄放氧活性的影响
• 3.5.6 抑制 LeFAD7 基因表达减轻高温胁迫下 PSⅡ光抑制
• 3.5.7 高温胁迫对番茄叶片相对电导率的影响
• 3.5.8 高温胁迫对番茄叶片对番茄叶片叶绿素含量及叶绿体超微结构的影响
• 3.5.9 高温胁迫对番茄叶片可溶性蛋白含量的影响
• 3.5.10 高温胁迫对番茄叶片活性氧清除酶活性的影响
• 3.5.11 高温胁迫对番茄叶片 MDA 含量的影响
• 3.5.12 抑制 LeFAD7 基因表达降低花粉活性
• 3.5.13 抑制基因表达对番茄果型的影响
• 3.6 LeFAD7 基因在番茄中过量表达后转基因植株的鉴定
• 3.6.1 LeFAD7 基因在番茄中过量表达后转基因植株的分子检测
• 3.6.2 LeFAD7 基因在番茄中过量表达后改变番茄叶片类囊体膜脂的组成
• 3.6.3 低温弱光胁迫下过量表达LeFAD7 基因对番茄叶片放氧活性的影响
• 3.6.4 过量表达 LeFAD7 基因减轻低温弱光胁迫下 PSⅠ的光抑制
• 3.6.5 过量表达 LeFAD7 基因减轻低温弱光胁迫下番茄叶片 PSⅡ的光抑制
• 3.6.6 低温弱光胁迫对番茄叶片相对电导率的影响
• 3.6.7 低温胁迫对番茄叶片叶绿素含量及叶绿体超微结构的影响
• 3.6.8 低温弱光胁迫对番茄叶片可溶性蛋白含量的影响
• 3.6.9 低温弱光胁迫对番茄叶片活性氧清除酶活性的影响
• 3.6.10 低温弱光胁迫对番茄叶片 MDA 含量的影响
• 4. 讨论
• 4.1 LeFAD7 基因序列特征分析
• 4.2 膜脂组成与植物抗逆性
• 4.2.1 抑制 LeFAD7 基因表达与植株耐热性
• 4.2.2 过量表达 LeFAD7 基因与植株耐冷性
• 5. 对进一步研究的建议
• 6. 结论
• 7. 参考文献
• 8. 附录
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 9. 致谢
• 10. 攻读博士学位期间已发表和待发表论文情况附录