论文摘要
目的:探索人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stromal cells,hMSCs)体外分离、培养及纯化的合适实验条件,并探讨神经生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化成神经细胞的可行性。方法:①从正常成人髂骨中获取hMSCs,采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法相结合的方法分离人骨髓低密度单个核细胞,常规传代、培养获得纯化的hMSCs。②取第2、4、6代生长状态良好的hMSCs,以含胎牛血清的DMEM培养液培养消化后,采用MTT法,描绘细胞增殖曲线。③取第3～5代hMSCs,接近70%～80%融合后,分为实验组:用碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)对hMSCs进行预诱导24h,再分别用浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml神经生长因子培养基诱导分化;对照组:仅加等量无血清培养基。通过形态学观察诱导后各组细胞形态变化。④细胞培养后,第0.5d、1d、3d、5d,采用免疫组织化学法检测神经干细胞标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)的表达,选细胞密度适中视野计算阳性细胞数,对比各组细胞阳性表达比例。结果:①骨髓间充质干细胞的生长曲线:培养第1～2d为潜伏期,细胞生长缓慢;此后,细胞增殖加快并迅速进入对数生长期,至第6～7d达到高峰,以后细胞增殖减慢,进入平台期。②hMSCs诱导分化后的形态学观察结果:12h后部分细胞形态发生改变,表现为胞体变大,有类似轴突和树突的细长突起,24h后表现更为明显,部分细胞间也可见网络状排列,细胞死亡现象不明显;对照组无明显的形态学改变,仍为长梭形细胞。③神经元样细胞免疫组化测定结果:不同浓度神经生长因子组NSE、Nestin表达均为阳性,表现为胞体和突起被染成棕黄色;对照组无阳性结果出现。④不同浓度神经生长因子作用下的神经元样细胞分化率有差别。浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、及200ng/ml分化率分别为(35.6±4.4)%、(61.9±3.4)%、(57.3±5.7)%和(57.2±4.8)%,不同浓度的神经生长因子诱导阳性细胞数有显著差异(F=338.71,P<0.05),其中100ng/ml组的分化率最高,各实验组比较:浓度为100ng/ml、浓度为150ng/ml及浓度为200ng/ml组阳性细胞数均高于浓度为50ng/ml组(P<0.01),但后三者比较,差异无显著性(P>0.05)。⑤100ng/ml NGF在0.5d、1d、3d、5d的分化率分别为(27.8±5.6)%、(60.5±6.7)%、(61.9±3.4)%和(30.7±3.5)%,不同时间相同浓度下神经生长因子诱导阳性细胞数有显著差异(F=136.03,P<0.01),其中第3d的分化率最高,但与第1d阳性细胞数比较,差异无显著性(P>0.05),第5d的阳性细胞数减少,与第1,3d比较差异有显著性(P<0.01)。结论:①本实验建立的密度梯度离心法和全骨髓贴壁法相结合,体外分离、纯化hMSCs的方法,可能是目前操作简单、不易污染及分离纯度高的一种较好的方法。②NGF可诱导hMSCs定向分化成神经元样细胞且存活时间长,100ng/ml浓度的NGF可以起到较好的促进hMSCs向神经元样细胞分化的作用。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 神经生长因子论文; 神经细胞论文;