利迪链霉菌初级代谢关键基因的克隆与功能分析

论文摘要

利迪链菌素是利迪链霉菌产生的一种结构全新、抑菌效果明显的新型抗生素,具有很高的潜在应用价值。然而利迪链菌素的产量低是其应用的限制因素,加强初级代谢途径,提高其产量是一条可行的途径。本文克隆了利迪链霉菌初级代谢的几个关键基因,并进行了功能分析。研究了利迪链霉菌对木糖的利用能力,结果表明利迪链霉菌能利用木糖作为唯一碳源,但生长比较缓慢。在低浓度葡萄糖培养基上,木糖对生长具有显著促进作用。从利迪链霉菌中克隆到了木糖代谢的关键基因木酮糖激酶编码基因xylB,长度为1446bp,编码481个氨基酸。这表明,虽然利迪链霉菌利用木糖效率低,但仍然具有木糖代谢的遗传基础。采用同源克隆策略,克隆了利迪链霉菌葡萄糖代谢途径中的4个基因。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf2,长度1542bp,编码513个氨基酸,在242-252位具有AXXXGXGGXA （可能的NADP+结合位点）结构域,43位具有保守残基K（可能的葡萄糖-6-磷酸结合位点）。葡萄糖激酶编码基因glkA,长度954bp,编码317个氨基酸。磷酸果糖激酶基因pfkA1,长度1026bp,编码341个氨基酸。XylB,GlkA,PfkA1属于糖激酶,基于广义酸碱催化机理分析,催化活性区域可能分别为PYLDGERT （326-333位）, CXCGXGCXEXY （168-180）,DIXXTDXTXTFGFD （125-140位）。异柠檬酸脱氢酶基因idh长2220bp,编码739个氨基酸,Idh催化活性区域可能是HLKATMM（254-260位）。构建了zwf2组成型强表达载体,通过接合转移,将其转化到利迪链霉菌中。经过筛选鉴定,得到了重组利迪链霉菌。通过以上糖代谢关键基因克隆与功能分析研究,并构建了zwf2高表达菌株,为以后深入研究初级代谢对利迪链菌素生物合成的影响奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 链霉菌及利迪链菌素
• 1.1.1 链霉菌
• 1.1.2 利迪链菌素
• 1.2 提高微生物目标产物产量的遗传学方法
• 1.2.1 随机筛选法
• 1.2.2 推理选育法
• 1.2.3 原生质体融合技术
• 1.2.4 核糖体工程
• 1.3 代谢工程途径改造
• 1.3.1 代谢工程
• 1.3.2 利用代谢工程组合生物合成新型抗生素
• 1.3.3 改造次级代谢途径提高抗生素产量
• 1.3.4 改造初级代谢途径提高抗生素产量
• 1.4 本文的研究意义和主要研究内容
• 第二章 利迪链霉菌中木糖代谢的初步研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 利迪链霉菌培养
• 2.1.4 大肠杆菌的培养
• 2.1.5 利迪链霉菌生长曲线的测定
• 2.1.6 利迪链霉菌在不同碳源上生长量的测定
• 2.1.7 链霉菌染色体DNA的提取
• 2.1.8 基因克隆的PCR反应
• 2.1.9 PCR体系中目的片断的回收
• 2.1.10 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.11 T载体连接反应
• 2.1.12 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备
• 2.1.13 转化反应与蓝白筛选
• 2.1.14 菌落PCR
• 2.1.15 碱裂解法提取质粒
• 2.1.16 酶切验证
• 2.1.17 DNA序列的测定
• 2.1.18 同源克隆的克隆策略和引物设计
• 2.1.19 对木酮糖激酶 XylB 基因进行分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 利迪链霉菌的生长曲线
• 2.2.2 以木糖为单一碳源木糖量对链霉菌生长的影响
• 2.2.3 木糖和葡萄糖混合碳源对链霉菌生长的影响
• 2.2.4 木糖代谢途径和糖酵解途径的关系
• 2.2.5 克隆木酮糖激酶编码基因xylB及功能分析
• 2.3 小结
• 第三章 利迪链霉菌葡萄糖代谢关键基因的克隆与功能分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 生化试剂和仪器
• 3.1.3 初级代谢基因的克隆
• 3.1.4 同源克隆的克隆策略和引物设计
• 3.1.5 序列分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 克隆葡萄糖-6-磷酸编码基因zwf2 与功能分析
• 3.2.2 克隆葡萄糖激酶编码glkA与功能分析
• 3.2.3 克隆磷酸果糖激酶激酶编码基因pfkA1
• 3.2.4 克隆异柠檬酸脱氢酶编码基因idh
• 3.3 小结
• 第四章 高表达zwf2 工程菌株的构建
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 生化试剂和仪器
• 4.1.3 ET12567（pUZ8002） 感受态细胞的制备
• 4.1.4 zwf2 基因引物的重新设计
• 4.1.5 PCR zwf2（链霉菌表达）基因
• 4.1.6 PCR产物,酶切产物纯化
• 4.1.7 强组成型表达载体与zwf2 的连接
• 4.1.8 接合转移供体菌的构建与验证
• 4.1.9 zwf2 基因结合转移
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 zwf2 的PCR结果
• 4.2.2 zwf2 组成型强表达型载体构建
• 4.2.3 ET12567-pIB139-zwf2 的确认
• 4.2.4 结合转移菌株的筛选
• 4.3 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢