棉花抗枯萎病抗性转化机理的初步研究

论文摘要

新陆早7号和新陆早16号棉花品种对棉花枯萎病菌（ Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）7号生理小种表现高度感病。本文以这两个棉花品种和其经过病圃定向筛选3年、2年对枯萎病抗性有明显提高的材料为研究对象,运用液体培养棉苗孢子悬浮液浸根接种的方法,针对接种后抗、感材料的病理学变化和差异表达的基因进行了研究,旨在从病理学和分子生物学角度揭示感病棉花品种经过病圃加压定向筛选后抗性发生转化的机理。1、通过对2种不伤根的棉花枯萎病接种方法,即全生育期的田间病圃鉴定法和液体培养棉苗孢子悬浮液浸根法进行对比,结果表明,液体培养棉苗孢子悬浮液浸根法（接种浓度为107个分生孢子·mL-1）全周期只需要30天,通过这种方法,可以在较短时间内鉴定出棉花品种对枯萎病菌的抗、感病性。对比不同浸根接种时间（10、20、30、40、50、60 min）对结果的影响,发现浸根接种40 min可加快发病,鉴定结果和田间病圃鉴定的结果基本一致。2、通过电子显微镜和光学显微镜观察接种后抗、感材料根部组织的病理学变化,发现二者在宏观和微观病理学方面均存在一定差异。在宏观病理学方面的差异表现为:感病品种接种7天开始显症,25天严重发病,整个植株维管束变色;但抗病材料生长健康或只有轻微症状,维管束变色部位只局限在子叶节以下。在细胞和组织病理学方面的差异为:侵入后前期,抗病材料被侵入的细胞中有细胞壁加厚现象;侵入中期,病菌可通过表皮层侵入感病品种的薄壁组织,却只能到达抗病材料的皮层组织中;侵入后期,抗病材料中出现了大量寄主细胞的降解物质或分泌物将菌丝包围,阻止了病菌进一步扩展。抗病材料无论抗侵入还是抗扩展的能力都比感病品种大大增强。3、利用差异显示PCR技术对接种枯萎病菌前后的抗、感材料中差异表达的基因进行了初步研究。结果显示,反转录获得cDNA第一链,用3个锚定引物和4个随机引物组合扩增的DDRT-PCR产物,经测序胶电泳分离回收,二次扩增共得到约62个差异条带。进一步通过反向Northern杂交验证,发现其中有8个是抗病诱导增强的阳性条带。经克隆、测序并进行同源性比对分析,结果表明,除14-3外,其余差异基因条带都可以找到同源性较高的序列。其中10-5、22-11和22-6与盐胁迫下松科植物的抗菌素cDNA同源性分别达到100%,100%和96%;22-2与缺氮条件下松科植物cDNA的同源性为100%,推断其与植保素类物质的调控和生成相关;13-10与陆地棉纤维的cDNA同源性为100%,蛋白质序列比对发现它编码磷酸氧化酶相关的维生素类物质,推断其参与抗病相关酶类的合成途径;6-3与棉花根茎部幼嫩组织和纤维的cDNA同源性为99%,与陆地棉胚珠cDNA同源性为98%,10-7与假定的衰老相关蛋白mRNA同源性为98%。揭示这些差异表达的基因在抗性转化中的作用还需进一步克隆其全长cDNA以及对其功能进行深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国陆地棉抗枯萎病育种的历史
• 1.1.1 我国陆地棉抗枯萎病育种的发展分段
• 1.1.2 病圃定向筛选法在我国棉花抗枯萎病育种历史中的重要地位
• 1.2 棉花抗枯萎病鉴定方法的研究进展
• 1.3 棉花抗枯萎病菌的机理
• 1.3.1 棉花抗枯萎病遗传研究进展
• 1.3.2 棉花抗枯萎病的病理学研究进展
• 1.3.3 棉花抗枯萎病菌的生理生化研究进展
• 1.3.4 棉花抗枯萎病菌的分子生物学研究进展
• 1.4 差异显示技术（DDRT-PCR）的研究进展
• 1.4.1 转录水平分离和克隆基因的方法比较
• 1.4.2 差异显示技术（DDRT-PCR）在分离植物差异表达基因方面的应用
• 1.4.3 差异显示技术（DDRT-PCR）的改进和展望
• 1.5 立论依据及研究内容
• 1.5.1 立论依据
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 棉花枯萎病快速接种方法的建立及室内致病性鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 两种不同接种方法测定棉花对枯萎病抗病性的对比
• 2.2.2 不同接种方法所需时间的对比
• 2.2.3 不同接种时间对水培棉花孢子悬浮液浸根接种抗病性鉴定结果的影响
• 2.3 小结
• 第三章 定向筛选提高棉花抗枯萎病的病理学机制研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料和菌株
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同抗性棉苗接种枯萎菌后症状观察和剖杆检查
• 3.2.2 不同抗性棉苗接种枯萎菌前后根部组织结构的显微观察
• 3.2.3 不同抗性棉苗接种枯萎菌前后根部组织结构和细胞结构的超微变化
• 3.3 小结
• 第四章 定向筛选获得抗枯萎病棉花材料中抗病相关基因条带的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料和菌株
• 4.1.2 棉种的处理及棉苗的接种
• 4.1.3 棉苗的取样
• 4.1.4 RNA 提取
• 4.1.5 DDRT-PCR 反应
• 4.1.6 Reverse Northern 杂交验证
• 4.1.7 差异片段的克隆
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 棉花根部总RNA 的提取检测与纯化
• 4.2.2 mRNA 差异显示分析
• 4.2.3 差异条带的回收
• 4.2.4 Reverse Northern 杂交分析
• 4.2.5 差异片段的克隆
• 4.3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 棉花枯萎病快速接种方法的建立及室内致病性鉴定
• 5.2 定向筛选提高棉花抗枯萎病的病理学机制研究
• 5.3 定向筛选获得抗枯萎病棉花材料中抗病相关基因条带的鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表