苎麻生长素结合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及功能初步研究

论文摘要

苎麻（Boehmeria nivea）是一种重要的纤维作物,利用其皮层纤维的麻纺织品深受大众喜爱。苎麻的一年多季生长使关于其生长激素的研究具有充分的意义。当今一些模式植物生长素结合蛋白ABP1（Auxin-Binding Protein 1）的分子生物学研究取得了良好进展,为苎麻的相关研究提供了丰富参考。本研究以苎麻为材料,针对生长素结合蛋白基因cDNA开展了研究。通过分离苎麻总RNA并反转录成cDNA,采用简并引物扩增出生长素结合蛋白ABP1基因中间核心片段,然后通过RACE技术分别获得基因3′端包含多聚A尾的序列和5′端序列。克隆了苎麻ABP1基因cDNA,其序列全长849bp,可翻译成一段包含189个氨基酸的推导蛋白。经BLAST及蛋白质同源性分析,所克隆的cDNA序列即为苎麻ABP1基因cDNA,按照生长素结合蛋白基因命名规则将其命名为BnABP1,并将此序列提交GenBank,登录号为:EU195804。同源性分析表明,BnABP1蛋白与陆地棉（Gossypium hirsutum）GhABP1蛋白具有很高的一致性和同源性。为了进一步了解BnABP1在苎麻组织中的表达情况,揭示BnABP1表达调控机制,以BnABP1 cDNA 3′端非保守区域为检测序列,苎麻18S rRNA为内参基因,应用RT-PCR技术对BnABP1的表达进行半定量分析,建立了一个针对BnABP1的特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系。结果显示在三麻成熟期苎麻的茎、叶、芽中都可检测到BnABP1表达,但在根中则没有检测出,其表达模式为:芽＞叶＞茎,相对表达量依次为:0.755,0.632,0.360。根据BnABP1编码序列及原核表达载体pET-32a载体多克隆位点序列,采用PCR的方法将BnABP1 cDNA构建到pET-32a载体上获得融合表达载体pET-32a-BnABP1,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过IPTG的诱导和SDS—PAGE的方法初步分析了表达产物,能诱导产生一条预期大小的蛋白诱导带。通过PCR将BnABP1编码区的cDNA序列从T载体上释放,插入含GFP绿色荧光蛋白的植物转化载体pCAMBIA1300上,并置于35S启动子下游,构建了BnABP1基因GFP绿色荧光蛋白融合表达载体pCAMBIA1300-GFP-BnABP1。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法进行了烟草转化,获得了烟草转化愈伤组织。对烟草愈伤组织细胞游离后进行荧光显微镜观察,在细胞质膜和内膜系统上观察到较强烈的荧光信号。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 生长素结合蛋白ABP1
• 1.1 ABP1在植物体内的分布
• 1.2 ABP1的结构及性质
• 1.3 ABP1的亚细胞定位
• 1.4 ABP1基因
• 1.5 ABP1 cDNA的研究
• 1.6 ABP1在生长素信号转导中的作用
• 2 细胞核中的可溶性生长素结合蛋白SABP
• 3 问题与展望
• 4 本研究的意义
• 第二章 苎麻生长素结合蛋白基因BNABP1CDNA克隆及序列分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株
• 1.3 酶与试剂盒
• 1.4 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 苎麻RNA的提取与检测
• 2.2 RT-PCR获得苎麻ABP1基因cDNA中间片段
• 2.3 3′RACE获得cDNA 3′端序列
• 2.4 5′RACE获得cDNA 5′端完整序列
• 2.5 ABP1全序列的获得
• 2.6 苎麻生长素结合蛋白基因（ABP1）序列的生物信息学分析
• 3 实验结果与分析
• 3.1 苎麻总RNA提取
• 3.2 BnABP1基因中间片段的克隆
• 3.3 BnABP1基因3′端序列的克隆
• 3.4 BnABP1基因5′端序列的克隆
• 3.5 BnABP1基因全序列的克隆
• 3.6 序列分析
• 4 讨论
• 第三章 BNABP1基因组织表达的半定量分析（SEMI-QUANTITATIVE RT-PCR）
• 1 材料与试剂
• 1.1 酶与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 不同组织总RNA的提取
• 2.2 苎麻cDNA第一链的合成
• 2.3 半定量RT-PCR表达分析引物设计
• 2.4 PCR反应条件优化
• 2.5 不同组织BnABP1基因的扩增
• 2.6 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同组织RNA提取结果
• 3.2 PCR扩增体系的优化
• 3.3 反应条件优化结果
• 3.4 苎麻BnABP1基因在不同组织表达定量的结果
• 4 讨论
• 第四章 BNABP1基因原核表达载体的构建及诱导表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 工具酶及主要试剂
• 1.3 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计及目的基因的PCR扩增
• 2.2 融合表达载体pET-32a-ABP1的构建及检测
• 2.3 表达载体pET-32a-ABP1的转化
• 2.4 表达载体pET-32a-ABP1在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.5 表达产物的SDS-PAGE检测
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体pET-32a-ABP1的构建流程
• 3.2 目的片段与pET-32a载体双酶切结果
• 3.3 表达载体pET-32a-ABP1的菌落PCR及双酶切检测
• 3.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 4 讨论
• 第五章 GFP绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及对烟草的转化
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 植物材料及培养基
• 1.3 酶与试剂盒
• 1.4 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计及目的基因的PCR扩增
• 2.2 GFP绿色荧光蛋白植物表达载体pCAMBIA1300-GFP-ABP1的构建及检测
• 2.3 表达载体pCAMBIA1300-GFP-ABP1转化根癌农杆菌
• 2.4 叶盘法转化烟草
• 2.5 转基因烟草愈伤组织检测
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体pCAMBIA1300-GFP-ABP1的构建流程
• 3.2 目的片段与pCAMBIA1300-GFP载体双酶切结果
• 3.3 表达载体pCAMBIA1300-GFP-ABP1的菌落PCR和酶切检测
• 3.4 表达载体pCAMBIA1300-GFP-ABP1转化农杆菌LBA4404的检测
• 3.5 叶盘法转化烟草
• 3.6 转基因植株中BnABP1细胞定位情况检测结果
• 4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录A:BNABP1基因中间片段测序报告
• 附录B:BNABP1基因3′RACE测序报告
• 附录C:BNABP1基因5′RACE测序报告
• 附录D:BNABP1基因全长测序报告
• 附录E:缩略词表
• 附录F:主要试剂配置
• 附录G:载体图谱
• 致谢
• 作者简介