海绵共生微生物氮循环功能基因与微生物种群多样性研究

论文摘要

从中国南海海绵Phakellia fusca分离出越来越多的天然产物,但其中微生物的组成还知之甚少。另一方面,对海绵微生物群落的定量研究还几乎没有。本研究中,主要以原核微生物16S rRNA基因为标记,通过克隆文库和实时荧光定量PCR方法对海绵Phakellia fusca原核微生物组成进行了全面的研究。而氨氧化类群则通过amoA基因和厌氧氨氧化细菌特异性16S rRNA基因作为标靶来研究。海绵Phakellia fusca中细菌的组成为Gamma-变形菌（78%）,Alpha-变形菌（7%）和Delta-变形菌（3%）,以及蓝细菌（12%）。海绵Phakellia fusca中放线菌的多样性较好,由棒杆菌（48%）,酸微菌（22%）,弗兰克氏菌（15%）,微球菌（13%）和链孢囊菌（2%）组成。而所有在海绵Phakellia fusca中发现的古菌都属于泉古菌。检测到的氨氧化类群微生物只有氨氧化古菌（AOA）。之后,对发现的微生物类群进行定量分析,最多的是细菌,第二的是古菌,再紧随其后的是放线菌。本研究拓展了海绵Phakellia fusca中微生物组成、丰度和生态学作用的信息。同时,对海绵共附生微生物可培养性和天然产物的研究也有帮助。海绵中生活着复杂、丰富的微生物,但这些微生物在氮循环中所起的作用还知道得不多,特别是海绵中的氨氧化细菌和反硝化过程。本研究中,调查了七种海绵中氮循环功能基因（amoA,nifH,nxrA,nirS和nirK）还有厌氧氨氧化细菌（AnAOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）。通过细菌amoA基因,在五种海绵中找到了氨氧化细菌（AOB）,包括Haliclona sp.,Lamellomorpha sp.,Placospongia sp.,Acanthella sp.和Pericharax heteroraphis。除此之外,还在四种海绵中找到了氨氧化古菌,包括Haliclona sp.,Lamellomorpha sp.,Spirastrellidae diplastrella和Mycale fibrexilis。同时,对这四种海绵中的古菌多样性进行了研究。特别是,在海绵Placospongia sp.,Acanthella sp.和Pericharax heteroraphis中,只发现了氨氧化细菌。这表明氨氧化细菌是这些海绵中主要的氨氧化提供者。另外,亚硝酸盐还原酶nirS基因只在海绵Spirastrellidae diplastrella中被发现,而nirK基因只在海绵Lamellomorpha sp.中被发现。对氨单加氧化酶和亚硝酸盐还原酶的系统发育研究,表明有大量的海绵共生微生物参与到氨氧化和反硝化的过程中,特别是一些细菌的参与者。大量序列的最相似序列都是未培养的,可能是一些在海绵中较新的序列,而nirK基因则是首次在海绵中被发现。同时,还有少量功能基因序列具有海绵特异性。总之,本研究增加了海绵内微生物参与到复杂氮循环的知识。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 海绵
• 1.1.1 海绵动物简介
• 1.1.2 海绵天然产物
• 1.2 海绵共附生微生物
• 1.2.1 海绵共附生微生物的可培养性
• 1.2.2 海绵共附生微生物的多样性
• 1.2.2.1 海绵共生微生物的垂直遗传
• 1.2.3 海绵共附生微生物的分子研究手段
• 1.3 海绵特定微生物类群的研究
• 1.3.1 海绵功能基因的研究现状
• 1.3.2 海绵氮循环微生物的研究
• 1.4 研究目的、内容、意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 研究意义
• 1.4.4 创新点
• 第二章 PHAKELLIA FUSCA 共附生微生物多样性及定量分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 海绵总DNA 的提取
• 2.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建
• 2.2.3 系统发育分析
• 2.2.4 实时荧光定量PCR
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 海绵Phakellia fusca 总DNA 提取
• 2.3.2 目标片断PCR 扩增结果
• 2.3.3 海绵Phakellia fusca 共附生原核微生物多样性
• 2.3.4 海绵Phakellia fusca 共附生氨氧化微生物多样性
• 2.3.5 海绵Phakellia fusca 共附生微生物定量分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 海绵氮循环微生物多样性的系统发育分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 海绵总DNA 的提取
• 3.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建
• 3.2.3 系统发育分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 海绵总DNA 提取
• 3.3.2 目标片断PCR 扩增结果
• 3.3.3 七种海绵氮循环微生物多样性
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 四种海绵中古菌多样性的分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 海绵总DNA 的提取
• 4.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建
• 4.2.3 系统发育分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 目标片断PCR 扩增结果
• 4.3.2 四种海绵中古菌的多样性
• 4.3.3 四种海绵中古菌的系统发育分析
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 结语
• 5.1 展望
• 参考文献
• 附录1.溶液试剂及培养基
• 附录2.实验所用仪器设备
• 附录3.海绵PHAKELLIA FUSCA 共附生微生物序列
• 附录4.海绵氮循环微生物功能基因序列
• 附录5.海绵共附生古菌16S RRNA 部分长度序列
• 致谢
• 待发表论文