酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因的克隆及表达

论文摘要

S-腺苷蛋氨酸（SAM）是一种广泛存在于各种组织和细胞中的生物小分子，具有转甲基、转硫和转氨丙基等重要生理作用，已成为治疗肝损伤、胆汁郁积和抑郁症等疾病的重要药物。提取酵母染色体DNA并以其为模板，通过PCR的方法获得目的基因sam2；PCR产物经纯化后与T载体相连，构建克隆载体pT-sam2；pT-sam2经EcoRI酶切、NcoI部分酶切后插入pET20b（+）载体信号肽pelB的下游，构建了胞外表达重组质粒，命名为pET0-sam2；再以构建成功的pET0-sam2为模板，设计一对尾-尾相对且5′端带有相同酶切位点的引物，应用全质粒PCR的方法将pET0-sam2中的pelB信号肽序列去除，全质粒PCR产物经NdeI单酶切、T4连接酶连接，构建胞内表达重组质粒，命名为pETI-sam2。结果表明胞外表达对宿主菌E.coli BL21（DE3）呈致死现象；胞内表达获得成功，重组菌经1mM IPTG诱导6h并在其培养基中添加L-蛋氨酸至终浓度为0.8％时，胞内SAM的量达到最高量，约为每升发酵液1.273g，比原宿主菌SAM的量高300倍。SDS-PAGE结果表明，重组蛋白主要以包涵体的形式存在于胞内，约占菌体总蛋白的16％且其相对分子量为43kD。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 S—腺苷蛋氨酸研究概况
• 1.1.1 SAM在生物体内的生理作用
• 1.1.1.1 转甲基作用
• 1.1.1.2 转氨丙基作用
• 1.1.1.3 转硫作用
• 1.1.2 SAM稳定化研究
• 1.1.3 临床应用研究
• 1.1.3.1 肝病
• 1.1.3.2 抑郁症
• 1.1.3.3 关节炎
• 1.1.3.4 纤维性肌痛、偏头痛
• 1.1.3.5 其它
• 1.1.4 SAM的生产现状
• 1.1.4.1 体外酶促法合成
• 1.1.4.2 化学法合成
• 1.1.4.3 微生物法合成
• 1.1.5 国内外研究进展
• 1.1.6 S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其基因
• 1.1.6.1 大肠杆菌的腺苷蛋氨酸合成酶及其基因
• 1.1.6.2 酵母的腺苷蛋氨酸合成酶及其编码基因
• 1.1.6.3 大鼠腺苷蛋氨酸合成酶及其编码基因
• 1.1.6.4 其它
• 1.1.7 腺苷蛋氨酸合成酶基因工程酶的构建和转化研究
• 1.1.7.1 腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建
• 1.2 外源蛋白的基因工程表达系统
• 1.2.1 表达系统的选择
• 1.2.2 大肠杆菌表达载体pET20b（+）和宿主菌BL21（DE3）简介
• 1.3 表达方式的选择
• 1.4 本论文的立题依据及研究内容
• 1.4.1 立题依据
• 1.4.2 主要研究内容
• 2 材料和试剂
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要试剂
• 2.4 培养基和常用溶液配制
• 3 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1 构建策略
• 3.1.1 TA克隆
• 3.1.2 胞外表达载体构建策略
• 3.1.3 胞内表达载体构建策略
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因的PCR扩增
• 3.2.1.1 引物的设计
• 3.2.1.2 Saccharomyces cerevisiae NL365染色体的提取
• 3.2.1.3 PCR扩增目的基因
• 3.2.1.4 PCR产物的回收
• 3.2.2 PCR产物的TA克隆
• 3.2.2.1 连接
• 3.2.2.2 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备
• 3.2.2.3 连接产物转化TG1感受态细胞
• 3.2.2.4 质粒的提取
• 3.2.2.5 酶切鉴定
• 3.2.3 胞外表达载体的构建
• 3.2.3.1 双酶切获得目的片段
• 3.2.3.2 双酶切获得载体
• 3.2.3.3 构建胞外表达重组质粒
• 3.2.3.4 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.4 胞内表达重组载体的构建
• 3.2.4.1 全质粒PCR扩增
• 3.2.4.2 Nde Ⅰ部分酶切全质粒PCR扩增产物
• 3.2.4.3 胞内表达重组质粒的构建
• 3.2.4.4 胞内表达重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.5 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.6 胞内表达产物的酶活测定
• 3.2.6.1 酶活定义
• 3.2.6.2 反应原理
• 3.2.6.3 腺苷蛋氨酸的分析检测方法
• 3.2.6.4 标准曲线的制作
• 3.2.6.5 细胞壁的破碎
• 3.2.6.6 酶活测定方法
• 3.2.6.7 胞内SAM含量的测定
• 3.2.7 表达产物是否为包涵体的鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 目的基因的PCR扩增
• 3.3.2 TA克隆的酶切鉴定结果
• 3.3.3 测序结果分析
• 3.3.4 胞外表达重组质粒的构建及鉴定
• 3.3.4.1 双酶切pT-sam2获得目的片段
• 3.3.4.2 载体pET20b（+）的双酶切及pETO-sam2的构建
• 3.3.4.3 重组载体pETO-sam2的双酶切鉴定
• 3.3.5 胞内表达重组质粒的构建及鉴定
• 3.3.5.1 全质粒PCR扩增产物的电泳检测
• 3.3.5.2 全质粒PCR扩增产物的NdeⅠ部分酶切
• 3.3.5.3 重组载体pETI-sam2的双酶切鉴定
• 3.3.6 诱导表达产物的SDS-PAGE鉴定及酶活测定
• 3.3.6.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 3.3.6.2 SAM标准曲线的制作
• 3.3.6.3 表达产物的酶活测定
• 3.3.6.4 胞内SAM含量的测定
• 3.3.6.5 表达产物是否为包涵体的鉴定
• 3.3.6.6 诱导物浓度对产物表达的影响
• 3.3.6.7 诱导时间对产物表达的影响
• 3.3.7 讨论
• 3.3.7.1 关于部分酶切
• 3.3.7.2 关于全质粒PCR
• 3.3.7.3 pETO-sam2对BL21（DE3）致死的可能原因
• 3.3.7.4 关于测序结果的讨论
• 3.3.7.5 诱导温度对产物表达的影响
• 3.3.7.6 乳糖代替IPTG作诱导物的可行性实验
• 3.4 展望
• 结论
• 附录A
• A.1 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因DNA序列
• A.2 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因的蛋白质序列
• 附录B
• B.1 SAM2测序结果（N端）
• B.2 SAM2测序结果（C端）
• 致谢
• 参考文献