论文摘要
文昌鱼是现存与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物，代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中的一个重要的过渡阶段，长期以来一直被作为研究脊椎动物起源与进化的模式生物。目前，文昌鱼的基因序列和表达模式已经被广泛应用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。本文从文昌鱼（Branchiostoma japonicum）中分离出了具有完整编码框的alpha-2 Macroglobulin（α2M）基因和fibronectin typeⅢdomain containing 3a （fndc3a）基因片段，并对fndc3a基因部分序列进行了原核表达。首先，根据alpha-2 Macroglobulin （α2M）基因序列同源性资料，利用兼并引物RT-PCR、5’RACE和3’RACE方法从文昌鱼中克隆了一个全长5545 bp的α2McDNA （Bjα2M），其中5’非翻译区78 bp，3’非翻译区874 bp，该cDNA包含的最大开放阅读框为4593 bp，编码一个1530个氨基酸的蛋白，该cDNA编码的蛋白氨基端有一个16个氨基酸的信号肽。Bjα2M成熟蛋白含1514个氨基酸残基，理论分子量为164.2 kDa，等电点为4.6。糖基化位点预测显示，在728，978，1298和1412位氨基酸处存在四个潜在的糖基化位点。多序列比对发现，Bjα2M与其它物种α2M一样含有三个功能区：诱饵区（bait region），内部硫酯键（internal thiolester）和受体结合区（receptor-binding domain）。系统进化分析发现，Bjα2M与海鞘α2M聚为一支，且位于脊椎动物α2M的根部，进一步表明了文昌鱼在进化上的地位。我们还研究了Bjα2M基因在文昌鱼中的表达情况，Northern blotting结果显示，Bjα2M在文昌鱼中的转录产物为一条带，大小为5500 bp左右，与我们从文昌鱼中克隆的Bjα2M cDNA的大小基本一致。切片原位杂交分析表明Bjα2M在成体文昌鱼组织中呈特异性表达，在肝盲囊和后肠中的表达量最高，在卵巢和鳃中也有表达。分组织实时定量PCR结果表明，Bjα2M在成体文昌鱼肝盲囊和后肠表达量最高，而其它各组织的扩增水平都很低，与切片原位杂交结果基本一致，进一步证明Bjα2M具有组织特异性表达。免疫组织化学结果显示，Bjα2M在成体文昌鱼肝盲囊的表达最为丰富。用lipopolysaccharide （LPS）处理文昌鱼，结果显示，在处理后8小时的鱼体中Bjα2M基因表达水平显著升高。因此，推测文昌鱼α2M可能是一种急性时相蛋白，参与宿主免疫防御。同时，我们也在文昌鱼中克隆了fibronectin typeⅢdomain containing 3a（Bjfndc3a）基因的部分片段，该基因片段长度为2621 bp，编码873个氨基酸，smart预测显示该多肽序列编码8个纤连蛋白typeⅢ基序和一个跨膜区域，其中，这8个纤连蛋白typeⅢ基序均不含有RGD三肽序列。Northern blot杂交结果显示Bjfndc3a在文昌鱼中的转录产物为两条带，分别为4.4 kb和4.7 kb，有研究表明人类HUGO （fndc3a）基因也有两条转录产物。鳗弧菌感染文昌鱼，应用实时定量PCR分析发现，感染12小时后的鱼体中Bjfndc3a基因表达水平显著升高，推测fndc3a可能是一种免疫相关分子，参与宿主免疫防御。选择Bjfndc3a部分基因序列设计表达引物，构建重组表达质粒，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。结果表明重组的Bjfndc3a部分基因在大肠杆菌中获得了表达，其大小为14 kDa。