论文摘要
近年来,水产流行病的发生给水产行业造成了很大的经济损失。由于鱼类是低等的脊椎动物,其特异性免疫系统不健全,主要依靠非特异性免疫抵御病原微生物的入侵。非特异性免疫成了水产研究的热点。草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国重要的淡水经济鱼类之一,养殖规模居“四大家鱼”之首。具有肉质好、生长快、养殖成本低等优点,但同时草鱼对多种病害的抵御能力较弱是养殖过程中流行病爆发的主要原因之一,国内每年因病害造成的损失高达数十亿元。草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）（一种双链RNA病毒）引起的草鱼主要流的行病之一。目前尚无特别行之有效的方法对该疾病进行预防和治疗,而鱼类自身特异性免疫系统不发达在某种程度也上使得疫苗使用效果受到影响,因此从先天免疫途径入手,寻找与抗GCRV相关的主效基因和多态性位点,为水产疾病的控制提供了新的思路。在物种进化过程中多细胞动物保留了许多相似的抗病毒先天免疫途径,其中以TLR（Toll-like receptors）、RLR（RIG-I-like receptors）和NLR（Nod-like receptors）等模式识别受体家族途径为代表。TLR家族抗病毒途径是多细胞动物中普遍存在的重要的抗病毒途径之一。目前发现该家族在哺乳动物上至少包括13个成员,水产动物中的种类更多。不同的成员识别不同的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMP）,并最终激发宿主产生一系列的抗病反应,因此阐明鱼类TLR家族在抗病毒过程中的作用并发现其与抗病之间的关联性具有重要意义。本研究以本实验室已经获得的草鱼TLR3基因的gDNA序列和表达模式为基础。根据gDNA序列设计引物通过混合DNA池测序、序列比对找到单核苷酸多态位点。设立对照,通过病毒感染实验获得易感组和抗性组的草鱼,利用PCR-RFLP的方法对各个单核苷酸多态位点进行酶切分型、统计分析。对于草鱼TLR22基因,通过同源序列比对,设计简并引物扩增部分片段,结合cDNA末端快速扩增、qRT-PCR等技术进行基因克隆和表达分析。然后根据所获得的草鱼TLR22基因序列进行生物信息学分析并对其在抗GCRV中发挥作用的机制进行了探索和基因多态性分析,取得了如下结果:（1） CiTLR3基因多态性与草鱼出血病抗性的关联分析利用12对引物扫描在草鱼TLR3基因gDNA全序列（编码区和非编码区）共发现12个单核苷酸多态位点,分别为-764 G/T、-613 A/C、-543 A/G、-488 G/T、-304 A/G、-106 G/T、-11 A/G、1811 A/G、3917 G/T、4116 G/T、4683 G/T、4731 C/T和一个插入缺失位点1 --/AT。这些多态位点中有七个位于第一外显子和5’UTR（Untranslated Regions）,三个位于外显子上,其余三个位于3’UTR。且位于外显子上的三个单核苷酸多态位点均为同意突变。统计分析结果显示-764 G/T单核苷酸多态位点基因型（P=0.040）与等位基因（P=0.025）在抗性组和易感组之间的分布均有显著差异。GG基因型和G等位基因与草鱼出血病抗性之间具有显著关联性。验证试验表明,GG基因型个体的死亡率明显低于GT与TT基因型个体,进一步验证了GG基因型与草鱼出血病抗性之间的关联性。连锁不平衡分析显示-543 A/G、-488 G/T、4116 G/T、4731 C/T之间存在连锁不平衡,单体型分析显示单体型GTTT与草鱼出血病的易感性之间具有显著关联性。（2） CiTLR22基因与草鱼出血病抗性的关联分析TLR22是水产动物所特有的TLR家族模式识别受体之一。主要识别双链RNA病毒分子并介导I型干扰素的分泌。本研究通过同源克隆技术,获得了草鱼TLR22基因序列,并通过病毒感染以及核酸类似物刺激证明了其在抗病毒过程中的作用。CiTLR22基因全长为3831 bp,编码了一个由954个氨基酸组成的蛋白质。该预测蛋白包括一个信号肽（Met1-Ala30）,17个富含亮氨酸的重复序列（LRR）,一个跨膜域和一个TIR结构域。通过构建系统发育树,发现草鱼TLR22与鲫鱼,金鱼和斑马鱼的TLR22蛋白亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果表明TLR22基因的mRNA在各组织中均有表达,在鳃中的表达量较高,而在肝脏、脾脏和脑中的表达量较低。GCRV感染以后,在脾脏和肝脏中TLR22的表达量均上调,在草鱼肾细胞中也得到了类似的结果。在草鱼肾细胞中,用5μg/ml, 10μg/ml, 25μg/ml的核酸类似物poly I:C刺激后,TLR22的表达量均上调,但是脂质体包埋后的5μg/ml的poly I:C刺激后,TLR22的表达量要低于未包埋处理的。在CiTLR22基因上共发现六个多态位点分别为-8 A/T、417 G/T、863 C/T、1923 G/T、2406 C/T、2574 C/T。经酶切验证,2406 C/T为一个突变点,位于外显子上的四个多态位点均为同意多态位点。经PCR-RFLP分析,417 G/T位点在基因型（0.013）和等位基因（0.015）上都与草鱼出血病抗性具有显著关联性。经连锁不平衡和单体型分析发现-8 A/T与2574 C/T,863 C/T与1923 G/T,863 C/T与2574 C/T之间存在连锁不平衡,但是所有的单体型均与草鱼出血病抗性无显著关联性。以上试验结果显示CiTLR22基因参与了识别双链RNA病毒的过程。CiTLR3基因中-764 G/T单核苷酸多态位点和-543A/G、-488G/T、4116G/T、4731 C/T之间的GTTT单体型以及CiTLR22基因中的417 G/T位点与草鱼出血病抗性之间具有显著关联性,为草鱼的抗病育种工作提供了重要的候选基因和靶位点。